編者按

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今天跟大家分享一篇2018年12月發(fā)表在Diabetes上的動物模型構(gòu)建+測序+實驗驗證的文章,題目為miRNA Regulation of the Hyperproliferative Phenotype of Vascular Smooth Muscle Cells in Diabetes,。本文章通過構(gòu)建1型糖尿病（T1DM）和2型糖尿?。═2DM）的大鼠動脈球囊損傷模型進(jìn)行RNA 測序,，生物信息學(xué)分析鑒定出6種可能引起糖尿病血管性疾病的miRNAs，分子實驗和臨床標(biāo)本驗證最終篩選出了低表達(dá)的miR-29c和高表達(dá)的miR-204參與了糖尿病血管性疾病,，并通過進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析和細(xì)胞,、動物實驗證明了在糖尿病疾病動物及細(xì)胞模型中，激活 miR-29c（靶向Emp2） 和抑制 miR-204（靶向Cav1)可防止動脈損傷后血管平滑肌細(xì)胞 (VSMC)過度增殖,。

圖注：文章流程圖

文章結(jié)果展示：

1,、作者構(gòu)建了1型糖尿病和2型糖尿病的大鼠動脈球囊損傷模型，通過BrdU染色和H&E染色證明了兩種糖尿病都可以加重中層 VSMC 的增殖反應(yīng),，增加了血管損傷部位的動脈狹窄,。

2、通過對上述模型的損傷血管組織進(jìn)行RNA-seq及生物信息學(xué)分析,，作者發(fā)現(xiàn)miR-195,、miR-29c、miR-140和 miR-199a-5p 在 T1DM 和 T2DM動物模型中均下調(diào),，同時,，miR-25 和 miR-204 在兩種 DM 類型中均特異性上調(diào)。這六種 microRNA可能參與調(diào)節(jié) DM 中 VSMC 的增殖反應(yīng),。

3,、在上述失調(diào)的6種miRNA 中，作者對它們在體外的功能進(jìn)行了初步評估并利用臨床上的人血管組織中繪制了表達(dá)譜,，最終發(fā)現(xiàn)miR-29c 和 miR-204具有最高特異性調(diào)節(jié)糖尿病依賴性 VSMC 增殖表型的潛力,。

4、接著作者利用高葡萄糖 (HG) ,、胰島素 (HI)以及血小板衍生因子(PDGF-BB)構(gòu)建VSMC細(xì)胞模型,，對miR-29c 和 miR-204進(jìn)行敲低和過表達(dá),，通過EdU染色和細(xì)胞周期檢測，進(jìn)一步證明了miR-29c 和 miR-204在VSMC 增殖中的作用,。

5,、隨后，作者對測序數(shù)據(jù)中的mRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析,，并對miR-29c 和 miR-204的靶標(biāo)基因進(jìn)行分析,，結(jié)果表明與 VSMC 表型增殖相關(guān)的幾種通路在兩種 DM 模型中都被激活，兩種 DM 模型中失調(diào)的 miRNA-mRNA 靶標(biāo)富集細(xì)胞周期,、細(xì)胞死亡,、及遷移相關(guān)的分子通路。

6,、為了進(jìn)一步確定miR-29c 和 miR-204的靶標(biāo)基因,，作者進(jìn)行了Ago 蛋白-RNA 免疫沉淀測定 (RIP)和熒光素酶報告基因?qū)嶒灒⒗蒙鲜鰳?gòu)建的細(xì)胞模型進(jìn)行功能驗證,，結(jié)果表明miR-29c 直接抑制 Emp2,，這是調(diào)節(jié) miR-29c 調(diào)節(jié) VSMC 增殖的主要靶標(biāo),，另一方面，miR-204 可以微調(diào) CAV1 蛋白的表達(dá)，該調(diào)節(jié)將 miR-204 和 miR-29c 活性聯(lián)系起來,，都在激活 VSMC 增殖的分子網(wǎng)絡(luò)中靶向 Cav1,。

7,、最后,，作者利用腺病毒（Adeno-Combo-miR-29c-m/miR204-i）給藥方式進(jìn)行了體內(nèi)實驗，再通過FISH等實驗驗證,，最終證明miR-29c 和 miR-204與它們的靶標(biāo) EMP2 和 CAV1 形成分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控,，在調(diào)節(jié)糖尿病中VSMC 增殖中起到關(guān)鍵作用。

總結(jié)

該文章通過高通量組學(xué)和適量的相關(guān)實驗證明了通過過表達(dá)miR-29c和靶向抑制miR-204可顯著減少糖尿病動脈狹窄,，為臨床糖尿病血管疾病的治療提供了非常好的靶標(biāo)和治療思路,。

Diabetes是中科院醫(yī)學(xué)1區(qū)Top期刊，在內(nèi)分泌領(lǐng)域有著非常高的權(quán)威,，該文雖發(fā)表于2018年,，但其套路非常經(jīng)典，一直沿用至今,，如2021年9月發(fā)表于Molecular Medicine（中科院2區(qū)雜志）的一篇名為MicroRNA regulation of the proliferation and apoptosis of Leydig cells in diabetes的文章,，基本是在該框架下設(shè)計的文章，值得大家學(xué)習(xí)品鑒,。

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