干眼癥(dryeyesyndrome,，xeorphhtalmia)又名結(jié)膜干燥綜合征,，是一種受眼部和/或全身多種因素(如眼表功能障礙、眼部外傷,、糖尿病,、炎癥等)影響出現(xiàn)淚腺低分泌而導(dǎo)致淚膜異常、眼表上皮干變的常見眼科疾病。干眼癥患者的臨床初始表現(xiàn)包括異物感,、干澀感,、發(fā)癢、燒灼感,、畏光,、視物模糊、易視疲勞,、難以名狀的不適及不能耐受有煙塵的環(huán)境等 ,。這些癥狀隨病情進(jìn)展而加重，最終出現(xiàn)角膜潰瘍甚至失明,。目前臨床主要通過外科手術(shù)或藥物治療來恢復(fù)淚液和黏液的分泌,，改善角膜組織病變，但都不能治愈,。建立合適的干眼動(dòng)物模型對(duì)藥物作用機(jī)制的探討,、藥物療效的評(píng)價(jià)以及干眼病因病機(jī)的研究都具有重大的意義。

淚液由淚腺分泌,，其中95%以上由主淚腺分泌,，少部分淚液來自副淚腺。淚液在眼表面形成淚膜,。淚膜由外向內(nèi)依次分為脂質(zhì)層,、水質(zhì)層和黏液層，脂質(zhì)層由瞼板腺,、Zeiss腺,、Moll腺所分泌。水質(zhì)層由主,、副淚腺所分泌,。黏液層主要由結(jié)膜上皮杯狀細(xì)胞分泌，部分由主淚腺分泌,。淚液的總量,、構(gòu)成、分布和淚膜間隙改變都能導(dǎo)致干眼的發(fā)生,。其中淚液滲透壓的升高和淚膜不穩(wěn)定是干眼癥發(fā)生的兩大核心機(jī)制，任何引起淚液滲透壓升高或淚膜不穩(wěn)定的因素都可導(dǎo)致干眼癥的發(fā)生,，且兩者互為因果,。大鼠的主淚腺分為眶內(nèi)淚腺和眶外淚腺，眶內(nèi)淚腺是哈德腺(Harderian gland),，眶外淚腺是漿液腺,。

一、干眼癥模型分類

按發(fā)病機(jī)制：按發(fā)病機(jī)制：可以分為淚液缺乏型和淚液蒸發(fā)過強(qiáng)型。

1,、淚液缺乏型干眼癥：先天性淚腺缺乏,、老年性淚腺功能降低、自身免疫性疾病,、淚腺外傷,、感染和自律神經(jīng)失調(diào)、長(zhǎng)期使用某種眼藥水,、服用某些藥物,，或是長(zhǎng)期戴隱形眼鏡都會(huì)導(dǎo)致淚液不足型干眼癥。

2,、蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼癥：淚膜的脂質(zhì)層能夠防止水樣淚液與空氣接觸而減少淚液蒸發(fā),，而脂質(zhì)層主要來源于瞼板腺。瞼板腺功能障礙會(huì)導(dǎo)致淚膜結(jié)構(gòu)改變,，穩(wěn)定性下降,，引起蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼癥。

按照造模手段可以分為四大類：藥物造模,、手術(shù)造模,、內(nèi)源性物質(zhì)缺乏和淚環(huán)境誘導(dǎo)。

二,、藥物誘導(dǎo)型

1,、 膽堿能受體拮抗劑誘導(dǎo)

原理：副交感神經(jīng)興奮能增加淚液分泌，膽堿能受體阻斷劑東莨菪堿是一種外周抗膽堿藥物,，能通過抑制副交感神經(jīng)興奮,，競(jìng)爭(zhēng)性抑制淚腺M受體，顯著降低淚液分泌進(jìn)而導(dǎo)致干眼癥癥狀,。

方法：在實(shí)驗(yàn)鼠皮下注射氫溴酸東莨菪堿注射液(3次/天),，后將動(dòng)物安置在雙面網(wǎng)格籠子里，復(fù)合風(fēng)扇模擬干燥環(huán)境(濕度控制在35%-40%),，每個(gè)周期為5-10天,。

特點(diǎn)：可建立淚液分泌不足合并蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼模型。該造模方法可引起淚液分泌量顯著減少,、結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)目減少,、角膜熒光染色增加等干眼體征。東莨菪堿對(duì)眼表損傷程度較輕,，對(duì)大鼠淚腺及眼表上皮細(xì)胞無明顯影響,，可用于制備早期輕、中度干眼癥模型,。

2,、苯扎氯銨誘發(fā)干眼癥模型   

原理：苯扎氯銨是一種季銨陽離子,，作為防腐劑廣泛用于保存眼科制劑，其可破壞角膜上皮細(xì)胞層的淺表面細(xì)胞間的緊密連接,，從而損傷角膜上皮細(xì)胞層的功能,，使用含有苯扎氯銨的局部滴眼劑會(huì)使干眼癥惡化。

方法：以0.2%的苯扎氯銨對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行點(diǎn)眼(每眼5μL/次,，3次/天),，連續(xù)7天。

特點(diǎn)：可建立嚴(yán)重型蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼癥,。該造模方法可引起淚膜穩(wěn)定性受損,、眼表炎癥、角膜上皮細(xì)胞凋亡與杯狀細(xì)胞丟失,、鱗狀上皮化生等,，其臨床表現(xiàn)和相關(guān)組織病理改變均類似于人干眼癥。

3,、淚液高滲透壓性干眼癥模型 

原理：淚液的高滲透壓是干眼上皮損傷的關(guān)鍵因素之一,，還可直接誘發(fā)眼表的炎癥反應(yīng)。正常人的淚液滲透壓是(302. 0 ± 9. 7) mOsmol /L,，干眼癥患者淚液的滲透壓是(326. 9 ±22. 1) mOsmol /L,。用>316 mOsmol /L作為干眼診斷的診斷指標(biāo)，其總體準(zhǔn)確度優(yōu)于其他任何一項(xiàng)干眼診斷指標(biāo),。研究表明,，小鼠眼表滲透壓達(dá)到500 mOsmol /L可以導(dǎo)致眼表炎癥反應(yīng)。

方法：實(shí)驗(yàn)鼠以500 mOsm·L^-1 氯化鈉溶液點(diǎn)眼(5次/天),， 持續(xù) 42天,。

特點(diǎn)：造模7天后，實(shí)驗(yàn)鼠角膜熒光素鈉染色評(píng)分增加,，角膜和結(jié)膜出現(xiàn)與干眼癥患者類似的體征和組織病理學(xué)變化,。

優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單可靠，重復(fù)性好,。

三,、手術(shù)造模型

1、暴露性干眼癥模型 

原理：通過手術(shù)減少動(dòng)物瞬目頻率,，使淚液蒸發(fā)過多,，淚液中黏蛋白缺乏，眼表組織繼而干燥失活,，角膜上皮細(xì)胞壞死缺損,，從而引起角膜上皮屏障功能損害而出現(xiàn)干眼癥狀。

方法：將實(shí)驗(yàn)鼠麻醉后固定,，消毒眼周皮膚,，用手術(shù)線褥式縫合上下眼瞼并分別固定于眶周相應(yīng)皮膚上，造模環(huán)境應(yīng)控制溫度在(20-23)℃,，相對(duì)濕度在(40±10)%,。

特點(diǎn)：可建立蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼模型，淚膜破裂時(shí)間縮短,、角膜熒光染色增強(qiáng),、淚流量明顯減少等，符合干眼癥的臨床癥狀,。

2,、淚液缺乏型干眼癥模型 

原理：摘除淚腺制成干眼模型。

方法：將實(shí)驗(yàn)鼠麻醉后固定,，于耳下方約1 cm處沿皮紋做橫行切口1 cm，暴露皮下微黃色圓形腺體(眶外淚腺),，分離周邊包膜將其完整摘除，生理鹽水沖洗,，縫合切口,；于眼外側(cè)1 cm 處做縱行切口1 cm，暴露皮下白色質(zhì)硬膜,，切開見一三角形腺體(眶內(nèi)淚腺),，將其完整摘除，生理鹽水沖洗,，縫合切口,。

特點(diǎn)：術(shù)后2周后開始出現(xiàn)干眼癥狀，第4周癥狀顯著,。如果僅去除大鼠眶外淚腺可以導(dǎo)致淚液量減少 50% 和角膜熒光染色的逐漸增加。

四,、內(nèi)源物質(zhì)缺乏型

維生素A缺乏干眼癥模型 

原理：維生素A中含有視黃酸,、視黃醛、視黃醇等活性衍生物,，可以維持正常視力和免疫系統(tǒng),。維生素A缺乏可導(dǎo)致上皮細(xì)胞過度角化,、淚腺分泌減少、角膜上皮及結(jié)膜干燥而引起干眼癥,。

方法：以干酪素為主的維生素A完全缺乏飼料喂養(yǎng)。

特點(diǎn)：6個(gè)月后,，可見淚腺萎縮,、結(jié)膜杯狀細(xì)胞減少、角膜上皮角化,，致使淚液分泌的質(zhì)與量改變,，眼表上皮干燥失活，淚膜穩(wěn)定性降低等干眼癥癥狀 ,。

五、淚液動(dòng)力學(xué)異常型干眼癥

1,、環(huán)境誘導(dǎo)型干眼模型 

原理：干眼癥的發(fā)病率和環(huán)境有著密切的關(guān)系。長(zhǎng)期于空調(diào)房,、密閉機(jī)艙,、電腦房等環(huán)境的工作人群誘發(fā)干眼癥的概率明顯增加,。為建立環(huán)境誘發(fā)干眼模型，可運(yùn)用全智能化系統(tǒng),，對(duì)室內(nèi)溫度,、氣流量、濕度等進(jìn)行嚴(yán)格的控制,。

方法：將實(shí)驗(yàn)鼠放置在相對(duì)濕度低于 20%,，溫度為21-23℃的受控環(huán)境中，連續(xù)14 d可在實(shí)驗(yàn)鼠中誘導(dǎo)得到急性干眼癥,。在無抗膽堿能藥物作用的情況下,，將急性干眼癥小鼠轉(zhuǎn)移到溫度為21-23℃、相對(duì)濕度為40%-60% 的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中繼續(xù)維持4個(gè)月,，可誘導(dǎo)形成慢性干眼癥,。

特點(diǎn)：干燥環(huán)境刺激造模方法可與其他方法聯(lián)用,，得到更加穩(wěn)定,、嚴(yán)重的干眼癥模型。

六,、干眼癥模型藥效評(píng)價(jià)指標(biāo)

1,、一般情況：鼠是否好斗,，及鼠掉毛、毛發(fā)斷裂,、揉眼的情況,；

2、眼表檢查：

動(dòng)物干眼癥癥狀可通過裂隙燈檢查角膜,、結(jié)膜等形態(tài)改變等進(jìn)行評(píng)判。裂隙燈主要觀察內(nèi)容包括：①淚河寬度有無變窄,；②角膜上皮的角化程度,，是否出現(xiàn)水泡、潰瘍,、血管翳等異常,；③角膜表層及下穹窿部有無碎屑；④結(jié)膜是否出現(xiàn)充血,、乳頭增生等,；結(jié)膜囊結(jié)膜有無松弛形成皺褶：⑤瞼緣是否充血；或出現(xiàn)不規(guī)整,、增厚,、外翻等,；腺口是否有清亮或黃色漿液阻塞,、腺管模糊等。早期或輕度的干眼癥動(dòng)物模型裂隙燈檢查大都無明顯異常,，須結(jié)合結(jié)膜熒光素染色試驗(yàn)進(jìn)一步檢查,。

結(jié)膜熒光素染色檢測(cè)方法：

滴2μL的1%熒光素鈉于眼球結(jié)膜囊內(nèi)，用0.25%氯霉素滴眼液進(jìn)行沖洗,，通過裂隙燈顯微鏡對(duì)染色情況進(jìn)行等級(jí)評(píng)定,。根據(jù)其著色程度和面積大小共分為四個(gè)等級(jí)：無染色為0分；散在稀疏的點(diǎn)狀染色為1分,；較為密集的點(diǎn)狀染色為2分,；染色呈片狀為3分，若點(diǎn)數(shù)不均以比例較大者為準(zhǔn),，評(píng)分越高角膜損傷越嚴(yán)重,。

圖注：A: 空白組角膜熒光素染色無異常; B: 模型組角膜熒光素染色示中央角膜點(diǎn)片狀著色

3、淚液檢查：包括淚液分泌試驗(yàn)和淚膜破裂時(shí)間,。

3.1 淚液分泌試驗(yàn)(Schirmer test)：

是對(duì)結(jié)膜受刺激后的基礎(chǔ)淚液和反射淚液總和的測(cè)量,，可最直觀估量水樣液分泌。分別于干預(yù)第0天,、7天,、14 天時(shí),，腹腔麻醉或氣麻后拉開實(shí)驗(yàn)鼠下瞼。

A:試紙法,。用眼科顯微鑷將1 mm × 15 mm的淚液試紙置于大鼠下瞼外1 /3結(jié)膜囊內(nèi),，2 min后取出，迅速測(cè)量試紙濕潤(rùn)長(zhǎng)度(精確到0.5 mm) ,，通常≥ 10 mm/5 min 為淚液分泌正常,。每只大鼠重復(fù)檢測(cè)3次，計(jì)算平均值,。

圖注：上：空白組,；下：模型組

B:酚紅棉線浸漬法。用眼科顯微鑷將酚紅浸漬棉線置于大鼠下瞼外1 /3結(jié)膜囊內(nèi),，停留30s取出,，棉線接觸淚液潤(rùn)濕后顏色變紅，測(cè)量紅色棉線的長(zhǎng)度(以mm為單位) 作為淚液分泌量的測(cè)量結(jié)果,。

圖注：上：空白組,；下：模型組

3.2 淚膜破裂時(shí)間(tear break up time，BUT) 

可分別于干預(yù)第0天,、7天,、14 天時(shí)檢測(cè)各組淚膜破裂時(shí)間。用1滴生理鹽水將熒光素鈉試紙浸濕,，用該試紙尖端輕觸實(shí)驗(yàn)鼠下眼瞼內(nèi)側(cè)并停留片刻,，對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠輔助眨眼3次使熒光素分布均勻，于裂隙燈鈷藍(lán)光下觀察角膜出現(xiàn)第1個(gè)黑色干燥斑點(diǎn)的時(shí)間,，每只實(shí)驗(yàn)鼠重復(fù)檢測(cè)3次,，計(jì)算平均值。通常BUT＞10 s為正常,。

4,、淚液蕨類試驗(yàn) 

實(shí)驗(yàn)鼠眼部未使用表面麻醉藥物，點(diǎn)樣毛細(xì)玻璃管在下瞼結(jié)膜囊淚阜處利用虹吸作用吸取淚液標(biāo)本,，盡量不接觸眼表,。將淚液標(biāo)本涂至潔凈載玻片上，25 ℃ (空調(diào)控制溫度)下干燥10-20 min 后,，置于光學(xué)顯微鏡下觀察淚液蕨類物的形態(tài)并拍照,。

圖注：A: 空白組淚液蕨類結(jié)晶圖像顯示形態(tài)良好的蕨類物形成；B: 模型組淚液蕨類結(jié)晶圖像分析顯示蕨類物邊界不清,，中間連接的顏色逐漸變淺

5,、角膜組織病理變化

 采用HE染色法。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用頸椎脫臼法處死鼠,，取角膜組織于固定液中固定72 h,，用梯度乙醇脫水、透明,、石蠟包埋后制成厚度約為5 μm的組織切片,，切片透明水化，HE染色,、封片,，于顯微鏡下拍照，觀察組織病理變化,。

圖注：A: 空白組; B: 模型組

注：空白組和模型組的鼠角膜HE染色觀察可見上皮分層良好,，分4-5層，基底部細(xì)胞排列呈柱狀,，向角膜表面分化逐漸變成鱗狀上皮細(xì)胞?？瞻捉M角膜組織細(xì)胞正常,，上皮層寬厚，基質(zhì)層細(xì)胞排列緊密,，無明顯病理特征; 模型組角膜組織上皮層顯著變薄,，基底層細(xì)胞部分缺失且排列疏松，上皮細(xì)胞分層紊亂,，細(xì)胞層數(shù)減少,，出現(xiàn)空泡。