慢病毒（Lentivirus）是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種,，它能夠?qū)谢驅(qū)氲揭恍┹^難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,，如原代細(xì)胞等，并且將靶基因隨機(jī)整合到宿主的基因組中,，從而大大增加了轉(zhuǎn)染效率,，并且能夠在細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)若干代，可以進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選,。

慢病毒表達(dá)載體包含了包裝,、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息,。慢病毒包裝質(zhì)?？商峁┧械霓D(zhuǎn)錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。

一,、什么叫質(zhì)粒

質(zhì)粒(Plasmid)是附加到細(xì)胞中的非細(xì)胞的染色體或核區(qū)DNA原有的能夠自主復(fù)制的較小的DNA分子,；一般來說，質(zhì)粒的存在與否對(duì)宿主細(xì)胞生存沒有決定性的作用,；它是基因工程最常見的運(yùn)載體,。

根據(jù)它們所帶有的基因和賦于宿主細(xì)胞的特點(diǎn)分為六種不同的類型：

二,、什么叫慢病毒載體

 慢病毒載體，指以人類免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 來源的一種病毒基因治療載體,。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,，它對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。慢病毒載體直接用于宿主細(xì)胞的感染,，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后,，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組,，從而高水平地表達(dá)效應(yīng)分子,。

三、質(zhì)粒的構(gòu)建

四,、慢病毒載體構(gòu)建及包裝流程

慢病毒包裝系統(tǒng)包括：2個(gè)包裝質(zhì)粒以及1個(gè)轉(zhuǎn)移質(zhì)粒,，將這些質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞,。2個(gè)包裝質(zhì)粒分別為：Gag/Pol表達(dá)質(zhì)粒和Rev表達(dá)質(zhì)粒。

1,、慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)上下游特異性擴(kuò)增引物,，同時(shí)引入酶切位點(diǎn)，PCR從模板（CDNA質(zhì)?；蛘呶膸欤┲姓{(diào)取目的基因CDS區(qū),，連入T載體；將CDS區(qū)從T載體上切下,，裝入慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒載體。

2,、慢病毒干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建

合成siRNA對(duì)應(yīng)的DNA頸環(huán)結(jié)構(gòu),，退火后連入慢病毒干擾質(zhì)粒載體

3、慢病毒載體的包裝與濃縮純化

制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒,，4種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提,，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后18h 更換為完全培養(yǎng)基,，換液30h后,，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，病毒上清液通過超離心濃縮病毒,。

五,、質(zhì)粒、慢病毒的應(yīng)用

質(zhì)粒的應(yīng)用：

1,、應(yīng)用于基因治療,，如質(zhì)粒DNA基因治療藥物（以質(zhì)粒DNA為載體的基因治療產(chǎn)品）；2,、外源基因的表達(dá),；3、基因工程：①微生物基因工程,；②植物基因工程,；③動(dòng)物基因工程。

慢病毒的應(yīng)用：

1,、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的基因治療,；2、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療,；3,、血液系統(tǒng)疾病的基因治療；
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