研究背景

研究結果

1. 植入前小鼠ROSI胚胎中轉(zhuǎn)錄組、染色質(zhì)可及性和DNA甲基化的概述

本研究中使用早期圓形精子細胞進行胞漿內(nèi)注射,，獲得ROSI胚胎,。之后進行單細胞RNA測序(scRNA-seq)，結果顯示,，圓形精子細胞為RS2期精子細胞,，仍處于精子發(fā)生的早期階段,。隨后證實，ROSI和卵胞漿內(nèi)單精子注射 （ICSI）胚胎在受精時的發(fā)育進程基本上是同步的,。ROSI和ICSI的微操作過程相似,，只是所使用的單倍體雄性生殖細胞發(fā)育階段不同。當胚胎構建在B6D2F1背景上時,，也觀察到類似的結果,。早期圓形精子細胞不成熟的表觀遺傳學狀態(tài)可能使它們在受精時對表觀遺傳重編程具有更強的抵抗力。ROSI和ICSI胚胎的所有活胎及其胎盤的重量都是差別不大的,，此外,，通過ROSI或ICSI獲得的成年小鼠的體重和繁殖能力也沒有區(qū)別，說明ROSI胚胎的發(fā)育缺陷處于一個相對狹窄的發(fā)育時間窗口內(nèi),，如果胚胎克服了這一問題,，則其后續(xù)的發(fā)育將相對正常。

多組學測序可以在單細胞分辨率下同時分析基因表達,、DNA甲基化和染色質(zhì)可及性,。為了探索ROSI胚胎的表觀遺傳重編程信息，對ROSI胚胎的每個細胞進行單細胞多組學測序,。本研究共納入138個ROSI胚胎,，90個ICSI胚胎作為對照，以消除胚胎微操作技術本身的影響,，覆蓋發(fā)育的6個關鍵階段,，以及包括精子、圓形精子細胞和中期卵母細胞在內(nèi)的配子,。結果顯示,，在ROSI胚胎著床前發(fā)育期間，DNA甲基化和染色質(zhì)可及性的重編程均有所提示,，但與ICSI胚胎相比仍表現(xiàn)出一定的變化,，特別是在原核階段。

如前所述,，ROSI胚胎在受精后原核階段發(fā)生的表觀遺傳重編程與ICSI對照相比有所不同;特別是ROSI胚胎的雄性原核階段具有獨特的表觀遺傳特征,。ROSI胚胎存在母體到受精卵過渡相關基因的錯誤表達，并表現(xiàn)出染色質(zhì)/細胞骨架組織缺陷,。qPCR 結果提示,，在ROSI胚胎中被下調(diào)的少量ZGA基因在染色質(zhì)和細胞骨架組織過程中富集，這表明少量ZGA基因的錯誤表達可能與染色質(zhì)/細胞骨架組織缺陷有關,。之后對ICSI和ROSI胚胎的原核形態(tài)進行分析,。結果提示，ROSI胚胎的雄性原核平均直徑明顯小于ICSI對照組，且該表型維持到PN5期,。此外,，在ROSI胚胎出現(xiàn)沉積，該沉積與多個染色質(zhì)特征密切相關,。

3.A366可提高ROSI胚胎的發(fā)育能力

基于單細胞多組學測序分析和實驗數(shù)據(jù),，ROSI胚胎的重編程缺陷主要發(fā)生在原核期，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳修飾的改變,。為了探索是否有此前未確定的小化合物可以通過靶向特定的表觀遺傳修飾來提高ROSI胚胎的發(fā)育潛力,。作者篩選了一個由178個小化合物組成的文庫，這些化合物針對表觀遺傳修飾,，包括DNA甲基化和組蛋白修飾,。基于ROSI胚胎的發(fā)育潛力,，從三個方面評估了這些小化合物的最終效果:(i)對早期胚胎無毒,，(ii)提高囊胚發(fā)育率，(iii)提高活產(chǎn)率,。為了證實異常H3K9me2沉積和Ehmt2過度表達會帶來那些表型,，作者分析了敲低或過表達Ehmt2后ROSI胚胎的發(fā)育能力,，結果提示,，敲低Ehmt2可顯著提高ROSI胚胎的囊胚率，相反,，當Ehmt2過表達時,，H3K9me2沉積增加ROSI胚胎囊胚率呈劑量依賴性下降。然而,，Ehmt2過表達組同時使用A366對胚胎進行處理,，則無法消除Ehmt2過表達對胚胎發(fā)育造成的阻滯。A366處理ROSI胚胎可使活產(chǎn)率提高約兩倍,。值得注意的是,，經(jīng)A366處理的ROSI胚胎的存活子代健康且可育。此外,，經(jīng)A366處理的體內(nèi)受精卵的活產(chǎn)率與對照組相當,，表明A366處理的安全性?？傊?，A366處理能顯著提高小鼠ROSI胚胎的發(fā)育水平。

4.A366可以部分克服早期圓形精子細胞產(chǎn)生的ROSI胚胎的重編程缺陷

為了探索A366如何改善ROSI胚胎的發(fā)育潛力,，對經(jīng)A366處理的ROSI胚胎進行了單細胞多組學測序,。對照組為未處理的ROSI胚胎和ICSI胚胎。根據(jù)基因表達譜對聚類細胞進行降維分析,。發(fā)現(xiàn)ROSI和ICSI胚胎可以被分離成兩個獨立的細胞簇,，說明這兩種胚胎的轉(zhuǎn)錄組在PN5期已經(jīng)表現(xiàn)出一定的差異,。值得注意的是，A366處理可以改變ROSI胚胎的全局基因表達模式,。然后使用DNA甲基化和染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)進行細胞聚類,。與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，A366處理的ROSI胚胎從男性和女性原核階段都恢復到獨立的細胞狀態(tài),。這些數(shù)據(jù)與A366可以影響ROSI胚胎發(fā)育潛力的發(fā)現(xiàn)一致,。