在電場(chǎng)的作用下將電泳分離的多肽從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體,，然后用這種多肽的特異抗體來(lái)檢測(cè)，經(jīng)常用于目的蛋白的表達(dá)特性分析,、組織定位,、表達(dá)量分析及與其他蛋白的互作。依其原理,，可分為兩種方法：A,、直接法和B、間接法,。

兩種方法比較：

好的蛋白是做出符合要求的目的條帶的前提：

經(jīng)驗(yàn)：我們通常使用BCA法來(lái)定量蛋白,，提取蛋白質(zhì)過(guò)程中，應(yīng)在低溫環(huán)境下進(jìn)行,，以抑制蛋白酶的水解作用,，可加入適合的蛋白酶抑制劑。當(dāng)提取磷酸化的蛋白時(shí)一定要加入磷酸化的蛋白酶抑制劑（磷酸化的蛋白極易降解）,。蛋白樣品建議分裝后冷凍干燥或直接以液體態(tài)置-80℃中保存,，不要反復(fù)凍融。

經(jīng)驗(yàn)：上樣時(shí)根據(jù)蛋白表達(dá)豐度調(diào)整蛋白上樣量,，盡量保證每孔上樣量保持一致,。膠最好現(xiàn)配現(xiàn)用，如果需要保存,，最好用濕潤(rùn)的保鮮膜包好并置于4℃冰箱中,。

經(jīng)驗(yàn)：膠在負(fù)極，膜靠近正極,；濾紙不要大過(guò)膜,，防止短路；夾好膜和凝膠后,，確定在凝膠,、膜和濾紙之間沒(méi)有氣泡存在,，否則會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不完全；注意一定要戴手套或塑料鑷子接觸膜,，避免手上的蛋白和油脂降低轉(zhuǎn)膜效率,。轉(zhuǎn)膜過(guò)程中，尤其是高電流快速轉(zhuǎn)膜時(shí),，通常 會(huì)有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象,，最好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。對(duì)于濕轉(zhuǎn)法：一般轉(zhuǎn)膜的電流在200mA,，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為120分鐘,。具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大,，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長(zhǎng),，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短,。

經(jīng)驗(yàn)：常見的封閉液有5%脫脂奶粉,、BSA和Western Blot膜封閉液（生物試劑公司提供）。但是封閉液的選取具體得看抗體說(shuō)明書,，有的抗體是明確要求只能用BSA,，而封閉液濃度的選擇也是具體得看抗體的要求，但是一般情況5%BSA會(huì)比5%牛奶的效果好,。選擇抗體時(shí),，一方面需要考慮所選抗體是否能識(shí)別凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至膜上的變性蛋白，另一方面需要考慮所選抗體是否會(huì)引起交叉反應(yīng)條帶,。

1.出現(xiàn)空白條帶

原因：出現(xiàn)空白條帶的原因比較多,，如一抗?jié)舛冗^(guò)低，二抗種屬加錯(cuò)（兔抗加成鼠抗）,，轉(zhuǎn)膜時(shí)間過(guò)長(zhǎng),、過(guò)短都會(huì)出現(xiàn)空白條帶。

解決方法：仔細(xì)檢查抗體是否加錯(cuò),，確認(rèn)轉(zhuǎn)膜時(shí)間沒(méi)有問(wèn)題。

經(jīng)驗(yàn)：如果條帶上沒(méi)有一點(diǎn)信號(hào),，大部分情況是抗體加錯(cuò)了,。如果出現(xiàn)細(xì)微條帶，可能是因?yàn)樯蠘恿刻?，蛋白量太低,。或是一抗?jié)舛鹊?，發(fā)光液失效,。當(dāng)然如果轉(zhuǎn)膜時(shí)膜放反了的話那肯定是不會(huì)出現(xiàn)條帶。所以實(shí)驗(yàn)時(shí)一定要細(xì)致認(rèn)真。

2.高背景

原因：封閉不夠好,，一抗?jié)舛冗^(guò)高,，洗膜時(shí)間和次數(shù)不夠。

解決方法：降低一抗?jié)舛?，增加洗膜時(shí)間和次數(shù),。

經(jīng)驗(yàn)：高倍鏡可能是WB中最長(zhǎng)出現(xiàn)的問(wèn)題，目的條帶單一清晰,，但是其他地方有彌漫性較為均一的背景,。洗膜時(shí)間按照5min*5次或者10min*3次。如果洗膜時(shí)間沒(méi)有偷工減料的話,，調(diào)整一抗?jié)舛染蜁?huì)得到干凈清晰的條帶了,。

3.非特異性條帶

原因：一抗非特異性與蛋白結(jié)合，一抗?jié)舛冗^(guò)高,。

解決辦法：更換一抗,。

經(jīng)驗(yàn)：這種情況絕大多數(shù)原因是因?yàn)橐豢共缓谩３霈F(xiàn)這種情況就無(wú)法判斷你需要的目的條帶是哪一條,。如果沒(méi)有條件更換更好的抗體建議試用陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照來(lái)判定那一條是你需要的目的條帶,。還有很小可能是因?yàn)橐豢節(jié)舛冗^(guò)高引起的非特異性結(jié)合。

4.條帶中出現(xiàn)白圈

原因：轉(zhuǎn)膜時(shí)膜和膠之前存在氣泡,。

解決辦法：轉(zhuǎn)膜前趕除膜與膠之間的氣泡,。

經(jīng)驗(yàn)：我們常常將電轉(zhuǎn)液倒入一個(gè)盤子里，倒入的液體不能太多也不能太少,，最好的高度是與放上第一層濾紙齊平,，然后往濾紙上澆點(diǎn)轉(zhuǎn)膜液，把電泳膠用清水清洗下,，將電泳膠平鋪到濾紙上,，仔細(xì)檢查濾紙與膠之間是否有氣泡，可以左右前后觀察,，不同方向觀察之后確認(rèn)無(wú)氣泡,，然后再往膠上面澆點(diǎn)電轉(zhuǎn)液，用兩只手的拇指和食指輕輕夾住PVDF膜的兩側(cè)中間,，使膜成U型,，然后將U型的底部接觸膠的中間，慢慢往兩邊放下膜,，這樣一般氣泡很少,。然后上層濾紙同樣用U型的放置方法，用切膠板壓住一邊另一塊切膠板從內(nèi)向外趕氣泡,，然后蓋上海綿,。注意不要來(lái)回趕氣泡,，這樣反而會(huì)帶入氣泡。

5.某個(gè)條帶變形

原因：SDSPAGE膠中存在氣泡或者某不溶性顆粒,。 

解決辦法：配膠過(guò)程中要小心,，使用無(wú)雜質(zhì)的液體。

經(jīng)驗(yàn)：很多實(shí)驗(yàn)室中使用的不是最新的設(shè)備,，比如配膠用的海綿墊,，如果用了很多年之后，會(huì)從下面往上面漏小氣泡,，當(dāng)氣泡足夠小并且膠快凝固的時(shí)候,，走到中間的小氣泡就停留在膠內(nèi)，并會(huì)影響到后面的跑膠,。另外配膠用的水,，SDS，Tris緩沖液要注意不要有雜質(zhì),。

6.最邊緣條帶彎曲

原因：電泳電流不均一,。

解決辦法：換用新的電泳槽； 不使用兩邊的兩孔,。 

經(jīng)驗(yàn)：一般我們使用的是10孔的的膠,，如果你上樣剛好10個(gè)孔，那么最兩頭的兩個(gè)孔肯定會(huì)歪曲,。另外上樣最好在膠的中間,，這樣電場(chǎng)均一。

7.其他問(wèn)題

（1）整個(gè)條帶呈 “ ︶ ” 狀：凝膠冷卻不均一,，電泳槽老化,；

（2）整個(gè)條帶呈“ ︵ ”： 凝膠左右兩頭沒(méi)有凝固好；

（3）溴酚藍(lán)拖尾：樣品溶解不好,；

（4）縱向的紋理：上樣樣品中存在不溶性顆粒,；

（5）溴酚藍(lán)很粗：濃縮膠濃縮效果不好，可能是濃縮膠太短,，或者是濃縮膠配錯(cuò),；

（6）在分離膠中跑不動(dòng)：Tris-Cl PH值不對(duì)，或者忘記加SDS,。