ELISA（酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)）是指將可溶性的抗原或抗體吸附到聚苯乙烯等固相載體上,，進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量方法。是免疫學(xué)研究中最常用的方法之一,，可用于測(cè)定抗原,，也可用于測(cè)定抗體。許多人覺得ELISA檢測(cè)一般有試劑盒或者方法步驟簡(jiǎn)單,，其實(shí)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程和結(jié)果分析中大家會(huì)遇到各種問題,，今就和大家分析一下常見的問題，希望對(duì)大家有所幫助,。

一,、ELISA實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

試劑盒的選擇

ELISA操作前，應(yīng)做好實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì),、選擇適合自己檢測(cè)范圍和靈敏度的試劑盒,、提前訂購(gòu)和準(zhǔn)備試劑及耗材、處理樣本等準(zhǔn)備工作,。 

樣本處理

在收集標(biāo)本前需有一個(gè)完整的計(jì)劃,，需要清楚要檢測(cè)的成份是否足夠穩(wěn)定。ELISA檢測(cè)提倡新鮮標(biāo)本盡早檢測(cè),，對(duì)收集后當(dāng)天就進(jìn)行檢測(cè)的標(biāo)本,，及時(shí)儲(chǔ)存在4℃備用，如有特殊原因需要周期收集標(biāo)本,，請(qǐng)取材后,，將標(biāo)本及時(shí)分裝后放在-20℃或-80℃條件下保存。因冰室與室溫存在一定溫差，蛋白極易降解,，直接影響實(shí)驗(yàn)質(zhì)量,，所以避免反復(fù)凍融。

二,、ELISA實(shí)驗(yàn)中的洗滌

洗滌是ELISA實(shí)驗(yàn)中是最多次數(shù)的操作,，也是非常重要的步驟。不嚴(yán)格的洗滌容易出現(xiàn)洗不干凈或交叉污染現(xiàn)象,，實(shí)驗(yàn)重復(fù)效果差的現(xiàn)象,。不管用多道加樣器、洗瓶,、吸管,，還是洗板機(jī)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作不要減少步驟洗滌的洗滌體積,、洗滌時(shí)間和洗滌次數(shù),。注意標(biāo)準(zhǔn)化操作將減少實(shí)驗(yàn)誤差和不同實(shí)驗(yàn)之間的誤差。操作者常出現(xiàn)洗板不干凈現(xiàn)象,，請(qǐng)比照以下操作

a)洗液不要溢出孔外,，以免污染相鄰的孔，特別是每次洗板的前兩遍,，若高濃度的孔污染了低濃度的孔或空白孔,，其造成的交叉污染的孔是洗不掉的，背景肯定會(huì)增高,。 

b)特別注意：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候要考慮實(shí)驗(yàn)孔的位置,，保證甩掉洗液時(shí)，空白孔,、低濃度孔或陰性對(duì)照組在上面或一側(cè)或分開最好,。同時(shí)注意甩掉洗液的動(dòng)作翻轉(zhuǎn)（從正上方旋轉(zhuǎn)120－150度）要迅速、干脆,。甩板不要手腕左右搖擺,、旋轉(zhuǎn)來(lái)甩液體，甩出后以直線方式補(bǔ)2－3次甩出液體,。  

c)用干凈的濾紙,，不要用衛(wèi)生紙，因?yàn)榧?xì)小粉塵或者碎屑容易吸附到孔底,，導(dǎo)致洗板不干凈,，結(jié)果偏高或偏低，重復(fù)孔的數(shù)值也會(huì)相差很大,。 

d)每次拍板不要重復(fù)在一個(gè)地方拍,，特別是洗去酶的步驟,；拍板不宜過(guò)輕，否則拍不干凈,，拍板很用力不會(huì)對(duì)蛋白有什么影響,。但注意不要太重，以至把板條給拍斷,。每次洗板后輕叩幾下,，最后一次一定要扣干凈,。 

e)不能減少洗液體積,、洗板時(shí)間和次數(shù)。洗板時(shí)間太短,，洗板效果不佳,。延長(zhǎng)洗板時(shí)間和增加洗板次數(shù)可以使背景更干凈。

三,、常見問題解析

1,、ELISA試驗(yàn)出現(xiàn)非常弱的結(jié)果，常見有7種原因,，其解決方法如下：

1)可能原因：溫育的時(shí)間或者溫度不夠,；

解決方法：校正溫育箱溫度。

2)可能原因：顯色反應(yīng)時(shí)間太短,；

解決方法：校正定時(shí)鐘準(zhǔn)確定時(shí),。

3)可能原因：所用配制緩沖液的蒸餾水有問題；

解決方法：使用新鮮合格的蒸餾水,。

4)可能原因：加入抗體/酶的稀釋液濃度太低,；

解決方法：按照說(shuō)明書保存試劑盒和準(zhǔn)確配制工作液。校正移液器,，吸嘴要配套,，裝吸嘴時(shí)要緊密。 

5)可能原因：酶標(biāo)儀濾光片不正確,；

解決方法：檢查酶標(biāo)儀使用的濾光片,。 

6)可能原因：試劑盒沒有充分平衡；

解決方法：試劑室溫平衡至少20分鐘,，確保所有試劑已平衡至室溫,。

7)可能原因：不正確的試劑儲(chǔ)存方式；

解決方法：按照說(shuō)明書要求保存試劑盒,。

2,、試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)定的重復(fù)性差，這是什么原因造成的,？

答：試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)定的重復(fù)性差,，這是典型的由測(cè)定操作引起的問題,，常見原因如下： 

a)可能原因：加樣本及試劑量不準(zhǔn)；孔間不一致,；

解決方法：校正移液器,，吸嘴要配套，裝吸嘴時(shí)要緊密,。

重復(fù)某一樣品時(shí),，加樣時(shí)間盡可能與第一次接近；

重復(fù)測(cè)定標(biāo)本,，操作條件,、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性,；

樣品稀釋前應(yīng)充分混勻,。 

b)可能原因：加樣過(guò)快，孔間發(fā)生污染,；

解決方法：重復(fù)測(cè)定標(biāo)本,，操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致,，以排除這些因素造成的不一致的可能性,；加樣不要過(guò)快。          

c)可能原因：加錯(cuò)樣本,；

解決方法：檢查記錄和試劑,，是否加錯(cuò)樣本。 

d)可能原因：加樣本及試劑時(shí),，加在孔壁上部非包被區(qū),；

解決方法：加樣槍頭不要貼壁。 

e)可能原因：不同批號(hào)試劑盒中組分混用,；

解決方法：不同批號(hào)試劑盒中組分不可混用,。 

f)可能原因：溫育時(shí)間、洗板,、顯色時(shí)間不一致,；

解決方法：檢查時(shí)間是否一致。

g)可能原因：孔內(nèi)污染雜物,；

解決方法：離心樣品,，排除雜物。 

h)可能原因：試劑/樣品沒有混勻,；

解決方法：充分混勻樣品和試劑,。

3、 試驗(yàn)結(jié)果白板,，而且陽(yáng)性對(duì)照不顯色,，應(yīng)如何分析和查找原因,？

答：試驗(yàn)結(jié)果白板，常見原因如下： 

a)可能原因：漏加或者誤加試劑,；

解決方法：檢查試驗(yàn)記錄和剩余試劑,。每次加液前均應(yīng)核對(duì)標(biāo)簽。

b)可能原因：試劑過(guò)期,；

解決方法：使用有效期內(nèi)的產(chǎn)品,。 

c)可能原因：洗板液配制中出現(xiàn)問題，如量筒不干凈含HRP酶抑制物（疊氮鈉等）,；

解決方法：使用干凈的器皿,，正確配制試劑。 

d)可能原因：溫育的時(shí)間或溫度不夠,；

解決方法：校正溫育箱溫度,。

e)可能原因：抗體失活或者丟失；

解決方法：更換抗體或者提高抗體濃度 

f)可能原因：酶失活或者丟失

檢查方法：把工作濃度的酶再稀釋20－100倍,，取5uL加入50ul的顯色底物，終止后顯色是否能達(dá)到1.0左右,，此為酶的粗略估計(jì),。

解決方法：更換酶或者提高酶的濃度。  

g)可能原因：顯色底物失活

檢查方法：加少量的工作濃度的酶,，TMB是否很快顯色,。

解決辦法：更換顯色底物.

4. 試驗(yàn)結(jié)果空白背景高，這是什么原因造成的,？

答：試驗(yàn)結(jié)果空白背景高,，常見原因如下：

a)可能原因：洗板不干凈；

解決方法：充分洗滌,，徹底拍干,；洗板要防止交叉污染；濃縮洗液準(zhǔn)確配制,；吸嘴盡可能一次性使用,；加樣或加酶拍板的濾紙應(yīng)棄去不用，不要反復(fù)使用,，否則易造成污染,。 

b)可能原因：顯色液變質(zhì)或者試劑過(guò)期；

解決方法：檢查試劑盒有效期,。 

c)可能原因：試劑稀釋有誤,，如加酶的濃度過(guò)高；

解決方法：請(qǐng)按說(shuō)明書所示稀釋倍數(shù)配制,；

d)可能原因：蒸餾水受酶等污染,；

解決方法：使用新鮮蒸餾水,；

e)可能原因：試劑混用；

解決方法：不同批號(hào)試劑勿混用,。 

f)可能原因：培養(yǎng)箱溫度超過(guò)37℃或反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),。

解決方法：顯色反應(yīng)時(shí)間適當(dāng)縮短。

最后一問：OD值換算成樣本濃度,，出現(xiàn)了負(fù)值,，該如何處理

1.血清濃度過(guò)高，大分子雜蛋白遮蓋了抗原表位,，檢測(cè)血清時(shí)要做相應(yīng)的稀釋（按試劑盒說(shuō)明書建議）,；

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線只取下面的4~5個(gè)濃度，把樣本的OD值全包括,，這樣就把標(biāo)準(zhǔn)曲線的下端（樣本濃度集中的一段）放大了,。

3.把0pg/ml點(diǎn)的OD值降低，低于最低樣本的OD值,，同時(shí)保證標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（r>0.98）,，這樣低的樣本值是正值，高的樣本值會(huì)更高,。

4.擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí),，用四參數(shù)擬合分析。