1  什么是骨髓間充質(zhì)干細胞(hMSCs)

      常見干細胞制劑主要分為成體干細胞,、胚胎干細胞及誘導(dǎo)的多功能干細胞（ipsc）三類,。今天小編要跟大家介紹的是骨髓間充質(zhì)干細胞（hMSCs）：骨髓間充質(zhì)干細胞是一種具有多分化潛能的成體干細胞，是人們在哺乳動物的骨髓基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的一種能在體外或體內(nèi)具有分化為成骨細胞,、軟骨細胞和脂肪細胞的多種分化潛能的細胞亞群,，據(jù)相關(guān)報道稱骨髓間充質(zhì)干細胞能分化成心肌、骨骼肌,、神經(jīng)細胞、造血干細胞,、肌腱,、肝組織、腎組織和連接組織,。它們對骨髓中的造血干細胞（HSC）不僅有機械支持作用,，還能分泌多種生長因子（如IL-6，IL-11,，LIF,，M-CSF及SCF等）來支持造血。

2 hMSCs細胞身份證

3  hMSCs細胞來源
       1999年,，Pittenger等首先用單細胞培養(yǎng)的方法獲得了人骨髓基質(zhì)細胞集落,，又將這些來自一個克隆的細胞分化為成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞。該細胞的分化實驗證明了骨髓基質(zhì)中確實存在具有多向分化能力的干細胞,。這些成纖維樣細胞被稱之為間充質(zhì)干細胞,。近年來科學(xué)家們還發(fā)現(xiàn)除骨髓以外，間充質(zhì)干細胞廣泛存在于脂肪,、皮膚,、胎盤、胸腺,、滑膜,、骨膜、牙髓,、骨胳肌,、外周血、臍帶血,、胚胎肝臟,、腦、胰腺,、脾,、腎等組織中。

4 hMSCs分離方法

       目前常用的分離hMSCs的方法主要有全骨髓法和密度梯度離心法,，全骨髓法即根據(jù)干細胞在低血清培養(yǎng)基中有貼壁優(yōu)勢特性,，定期換液除去不貼壁細胞，從而達到純化及擴增MSC的目的,。密度梯度離心法即根據(jù)骨髓中各細胞成分比重的不同,，分離單核細胞進行貼壁培養(yǎng)。二者本質(zhì)上無多大區(qū)別,。隨著對MSC表面抗原認識的深入,，又有人利用免疫方法如流式細胞儀法、免疫磁珠法等對其進行分離純化,。但經(jīng)過流式或磁珠分選后的細胞出現(xiàn)了增殖緩慢等一些問題,，加之成本較高和技術(shù)的難度，在某種程度上限制了這些方法的廣泛應(yīng)用,。

      現(xiàn)以密度梯度離心法介紹hMSCs的分離培養(yǎng)方法：

(1) 無菌條件下抽取骨髓液5mL,，用等體積PBS稀釋混勻，室溫下1500rpm離心10分鐘,；

(2) 棄去脂肪層,，將稀釋骨髓液沿離心管壁緩慢加到等體積Ficoll分離液（1.077g/mL）上面，室溫2500rpm離心30分鐘,；

(3) 吸取界面白膜狀層的單個核細胞,，用PBS混懸后,，室溫1500rpm離心10分鐘；

(4) 棄上清并重復(fù)洗滌2次,。

(5) 用含10%FBS的LG—DMEM培養(yǎng)液（或骨髓間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)基）重懸細胞,，調(diào)整細胞密度為2x105/mL，接種于底面積為25cm2培養(yǎng)瓶中置于37℃,、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),；

(6) 于3天后首次換液，棄去懸浮細胞后,，每2-3天換液一次,；

(7) 每日鏡下觀察細胞形態(tài)及生長變化，待細胞生長達80%-90%融合時,，用胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25%:0.02%）進行消化,，按1：2比例進行傳代培養(yǎng)。

圖一 分離第8d

圖二 分離第10d

圖二 分離第15d