近日,，南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理學系李學農(nóng)教授團隊在國際權威期刊《Molecular Cancer》（中科院SCI分區(qū)小類1區(qū),，影響因子41.44）上刊發(fā)了題為“circEXOC6B interacting with RRAGB, an mTORC1 activator, inhibits the progression of colorectal cancer by antagonizing the HIF1ARRAGBmTORC1 positive feedback loop”的研究論文。該文作者通過高通量測序篩選及qPCR等技術,，發(fā)現(xiàn)了在結直腸癌顯著下調的環(huán)狀RNA circEXOC6B,，闡明了環(huán)狀RNA circEXOC6B與RRAGB結合抑制其異源二聚體的形成，破壞其與RRAGC /D的相互作用,，從而阻斷mTORC1通路對營養(yǎng)的感知,，抑制HIF1A-RRAGB-mTORC1正反饋環(huán)，使腫瘤細胞生長受到抑制并增強常用化療藥物5-FU誘導的凋亡,。

研究背景

結直腸癌是全球發(fā)病率第二,，死亡率排名第三的惡性腫瘤，常用的放化療治療方法產(chǎn)生的耐藥性嚴重限制了治療效果,，探索結直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制是改善結直腸癌患者預后的關鍵,。近年來,，越來越多的研究表明，環(huán)狀RNA在調節(jié)腫瘤發(fā)展和化療耐藥性中起著至關重要的作用,。使用高通量RNA測序，作者先前發(fā)現(xiàn)circEXOC6B在結腸癌中表達下調,。然而,，其在結直腸癌（CRC）中的作用和機制仍然未知。

研究方法

通過qRT-PCR實驗檢測CRC組織中circEXOC6B的表達,進行體內(nèi)和體外功能實驗以確定circEXOC6B對CRC發(fā)展的抑制作用,通過RNA-pull down,、質譜,、co-IP、熒光原位雜交和免疫熒光,，研究circEXOC6B與CRC生長和5-氟尿嘧啶誘導的細胞凋亡的可能機制,。進行染色質免疫沉淀、雙熒光素酶測定,、Western Blot和免疫組化實驗用于探討HIF1A調節(jié)RRAGB轉錄的機制,。

研究結果

1. circEXOC6B在CRC組織中表達下調

作者首先通過qRT-PCR實驗測定CRC組織中circEXOC6B的表達，如圖1A所示,，與相鄰的非癌組織（正常）相比,，在78例CRC組織（癌癥）中，circEXOC6B表達下調,。為了探索circEXOC6B表達與CRC患者的臨床病理參數(shù)之間的關系,，再將78例CRC患者分為高表達組和低表達組（n=?39）,，根據(jù)circEXOC6B的中值表達進行統(tǒng)計分析，表明circEXOC6B的表達與腫瘤大小,、淋巴轉移和TNM分期呈負相關（圖1B和表S3）,。此外，還檢測了結腸癌cDNA芯片中circEXOC6B的表達,，該芯片包含80例癌組織和15例癌旁組織,。qRT-PCR結果顯示，circEXOC6B在癌組織中的表達也低于匹配的相鄰（正常）組織（圖1C）,。Kaplan-Meier生存分析顯示,，circEXOC6B高表達患者的總生存率（OS）（54.8%）高于circEXOC6B低表達患者總生存率（OS）（20.6%）（P=?0.042）（圖1D）。circEXOC6B表達較高的患者死亡風險較低（圖1E）,。最后,，多元回歸分析進一步證實，高circEXOC6B表達可將死亡風險降低49.4%（圖1F）,。這些結果表明,，circEXOC6B的表達與與CRC患者總生存期相關。

2. 體外實驗和在體實驗表明,，circEXOC6B可抑制CRC細胞的生長

為了研究circEXOC6B在CRC進展中的作用,，作者使用特異性靶向circEXOC6B的siRNA敲低了CRC細胞中circEXOC6B的表達，并使用circEXOC6B過表達載體上調了circEX0C6B的基因表達（圖2A和S2A）,。流式細胞術和CCK8,、EdU和集落形成實驗表明，敲低circEXOC6B的表達促進CRC細胞的增殖,、克隆形成和細胞周期,，而過表達circEXOC6B則抑制癌細胞生存能力和克隆形成（圖2B–D和S2B–E）。此外,，流式實驗結果表明,，敲低circEXOC6B抑制了5-FU誘導的CRC細胞凋亡，而過表達circEXOC6B濃度具有相反的作用（圖2E）,。

3. circEXOC6B與RRAGB結合,，干擾其異二聚體的形成

為了探索circEXOC6B調控CRC進展的分子機制，首先使用FISH,、PCR和qRT-PCR檢測了circEXOC6B在CRC細胞系和CRC臨床樣本中的亞細胞定位,。結果表明，circEXOC6B主要存在于CRC細胞的細胞質中（圖3A和S4）,。細胞質中的circRNAs可以與miRNA或蛋白質相互作用,，它們與蛋白質的結合被認為是它們的主要功能。為了鑒定與circEXOC6B相互作用的蛋白質,，作者在SW620和HCT116細胞中進行RNA-pull down,，隨后,，通過質譜分析鑒定了17種蛋白質。其中,，RRAGB是與circEXOC6B結合的候選蛋白,。通過RNA-pull down實驗，再進行western blot實驗,，證實了circEXOC6B和RRAGB的結合（圖3C）。此外,，RIP實驗驗證了RRAGB可以富集circEXOC6B（圖3D）,。為了進一步證實circEXOC6B和RRAGB的相互作用，在CRC細胞中使用FISH和IF標記circEXOC6B和RLAGB,。結果顯示,，在CRC細胞的細胞質中，circEXOC6B和RRAGB共定位,。此外,，使用catRAPID數(shù)據(jù)庫，預測了RRAGB與circEXOC6B的可能結合位點,。結果表明,，RRAGB中circEXOC6B結合的最可能區(qū)域位于250 aa位點附近（圖S6）。因此,，作者構建了不同長度的RRAGB表達載體（圖3F）,。RIP分析顯示，RRAGB的223–346 aa區(qū)域與circEXOC6B的相互作用（圖3G）,。有趣的是,，該區(qū)域包含RRAGB與RRAGC/D異二聚體的結合位點（圖3H）。因此,，作者推測,，circEXOC6B可能會競爭性地干擾RRAGB–RRAGC/D異二聚體的形成。為了驗證這一假設,，用標記RRAGB表達載體轉染CRC細胞后,，對其進行了Co-IP測定。Western blot結果顯示,，RRAGC和RRAGD與RRAGB的結合隨著circEXOC6B的過度表達而降低（圖3I）,。這些結果表明，circEXOC6B可以與RRAGB結合,，并抑制RRAGB和RRAGC/D的異二聚體形成,。

4. circEXOC6B抑制mTORC1通路

鑒于激活mTORC1途徑需要RRAGB-RAGC/D異二聚體的形成，我們推斷,，circEXOC6B可能通過干擾異二聚物的形成來抑制mTORC1通路,。Western blot結果顯示,，circEXOC6B的過表達降低了p-mTOR、p-S6K和HIF1A的表達,，而其下調增加了它們的表達（圖4A和B）,。與Western Blot結果一致，IHC表明皮下腫瘤中p-mTOR和HIF1A表達也上調,，circEXOC6B表達穩(wěn)定沉默（圖4C）,。此外，作者進行了挽救試驗,，以進一步驗證RRAGB參與mTORC1通路中circEXOC6B的調節(jié),。WesternBlot實驗顯示，RRAGB引起的p-mTOR,、p-S6K和HIF1A升高可以通過與circEXOC6B共轉染來逆轉（圖4D）,。RRAGB誘導的CRC細胞的增殖和克隆形成性增強也可以通過circEXOC6B的過度表達來挽救（圖4E-G）。這些結果支持以下假設：circEXOC6B通過競爭性結合RRAGB抑制mTORC1途徑以促進CRC生長,。

5. CRC具有HIF1A-RAGB-mTORC1正反饋回路,，該回路被circEXOC6B拮抗

作者使用qRT-PCR實驗檢測六種CRC細胞系中HIF1A和RRAGB的表達時，驚奇地發(fā)現(xiàn)HIF1A與RRAGB表達之間存在正相關（圖5B）,。此外,，HIF1A和RRAGB的表達水平在26個CRC組織中也呈正相關（圖5A）。同時使用GEO（圖S7A）和癌癥基因組圖譜（TCGA）（圖S7B）數(shù)據(jù)集進一步驗證了它們在CRC中的正相關性,。這些發(fā)現(xiàn)促使作者去探索HIF1A和RRAGB表達之間是否存在轉錄調控,。qRT-PCR實驗結果顯示HIF1A的敲低導致RRAGB mRNA表達的下調，而RRAGB的過表達對HIF1A mRNA表達沒有影響（圖5C）,。同時作者也發(fā)現(xiàn)RRAGB的啟動子區(qū)包含三個HRE（RCGTG）,，它們是轉錄因子HIF1A的結合位點（圖5C）。隨后的ChIP實驗表明HIF1A與啟動子的第二個HRE位點結合（圖5D）,。隨后,，作者構建了RRAGBWt和RRAGBMut（突變HRE）熒光素酶報告基因載體，進行雙熒光素素酶報告基因實驗（圖5E）,。結果表明,，敲低HIF1A表達后，熒光素酶活性降低,，但使用HIF1A激活劑ML228過度表達HIF1A后,，熒光素酶活力增加（圖5E）。這些結果表明HIF1A可以與RRAGB的啟動子結合并促進RRAGB轉錄,。mTORC1通路促進HIF1A的翻譯,。因此，HIF1A-RAGB-mTORC1正反饋環(huán)存在于CRC中,，以促進腫瘤進展,，而circEXOC6B可能通過與RRAGB結合來拮抗該環(huán),。作者使用HIF1A激活劑ML228上調HIF1A，Western Blot結果顯示RRAGB水平升高,。然而,，circEXOC6B能夠消除該效應并降低RRAGB和HIF1A的表達（圖5F）。此外,，circEXOC6B的過表達下調了RRAGB的表達,，而circEXOC6B的敲低則提高了RRAGG的表達（圖5G和H）。與Western Blot結果一致,，IHC結果顯示circEXOC6B表達穩(wěn)定沉默的皮下腫瘤比對照組具有更高的RRAGB表達（圖5I）,。為了進一步驗證circEXOC6B在正反饋回路中的抑制作用，使用IHC評估了22個CRC臨床樣本中HIF1A,、RRAGB和p-mTOR的表達，包括11例circEXOC6B低表達和11例circEXOC6B高表達,。結果表明,，HIF1A、RRAGB和p-mTOR水平在高circEXOC6B組中低于低circEXOC6B組（圖S8）,。

6.circEXOC6B增強CRC細胞對5-FU的敏感性

5-FU被廣泛用作CRC的一線化療藥物,。然而，5-FU的有效性因固有或獲得性化療耐藥性而降低,。近年來,，mTORC1和HIF1A通路的激活被認為是5-FU耐藥的關鍵原因。之前的流式實驗數(shù)據(jù)如圖2E所示,，表明circEXOC6B促進了5-FU誘導的CRC細胞凋亡,。此外，發(fā)現(xiàn)5-FU敏感細胞系RKO,、LoVo,、HCT116和HT-29中circEXOC6B的表達高于5-FU非敏感細胞系SW620（癌癥數(shù)據(jù)庫中藥物敏感性基因組：https://www.cancerrxgene.org/)（圖S9）。因此,，circEXOC6B可能通過抑制HIF1A-RAGB-mTORC1正反饋回路來增強CRC細胞對5-FU治療的敏感性,。為了進一步評估circEXOC6B對5-FU治療的影響，進行TUNEL檢測5-FU誘導的細胞凋亡實驗,。結果表明,，較低的circEXOC6B表達減少了5-FU誘導的CRC細胞凋亡，而較高的circEXOC6B的表達使CRC細胞對5-FU治療更敏感（圖6A）,。此外,，circEXOC6B的敲低降低了凋亡標志物裂解caspase-3和裂解PARP的表達，而其過度表達增加了其表達（圖6B）,。與凋亡結果一致,，CCK8測定顯示circEXOC6B的下調拮抗了5-FU在CRC細胞增殖中的抑制作用,。相反，circEXOC6B的上調增強了5-FU對增殖的影響（圖6C）,。此外,，通過構建裸鼠成瘤，以測試circEXOC6B在體內(nèi)5-FU治療中的作用,。腹腔注射5-FU后,，sh-circEXOC6B組的腫瘤體積與未治療組無差異。相比之下,，5-FU治療后,，sh-NC組的腫瘤大小顯著減小（圖6D和E）,。此外,，在sh-circEXOC6B組中，凋亡標志物裂解的caspase-3的表達沒有增加,，但在sh-NC組中顯著升高（圖6F）,。與caspase-3的表達一致，TUNEL結果顯示,，5-FU治療后,，sh-circEXOC6B組的凋亡沒有變化，而5-FU處理后,，sh-NC組的凋亡顯著增加（圖6G）,。這些發(fā)現(xiàn)表明，circEXOC6B增強了CRC細胞對5-FU的敏感性,。

結論

本研究揭示了HIF1A-RRAGB-mTORC1正反饋回路的存在,，該回路驅動結直腸癌的惡性演進， 而circEXOC6B抑制結直腸癌的生長并增加5-FU誘導的結直腸癌細胞凋亡（附圖）,。這些結果為HIF1A和mTORC1通路之間的串擾提供了新的見解,，并提出了阻斷結直腸癌進展的潛在治療靶點，揭示了環(huán)狀RNA調控結直腸癌生長及化療敏感性的新機制,，為尋求結直腸癌治療新靶點提供了新的技術途徑,。