科研狗做了一天的實驗,，本來高高興興,。

實驗試劑,，復(fù)核，完美,！

實驗步驟,，復(fù)核，完美,！

實驗儀器,，復(fù)核，也完美,！

但~~

難道,，這就是傳說中的水逆?。?/span>

科研狗都知道水逆是個玄學(xué),，但有時候水逆寶寶表示

那么到底是哪里出了問題呢,？其實有時候我們在取樣和樣本保存的時候，一些細節(jié)問題沒注意到,，那么就會導(dǎo)致整個實驗所有的努力白費。特別是一些剛進實驗室的熊孩子們,，一頓操作猛如虎,，一看結(jié)果全是哭！

好了,，好了,，小拓今天就來整理一下，一些常規(guī)實驗樣本保存方法及注意事項,，包括：分子實驗,、蛋白實驗、病理實驗,、透射電鏡,、生化檢測。

一,、分子實驗（RNA/DNA）

RNA提?。≦PCR/測序等）

1.組織樣本

組織取材在組織離體 30min 內(nèi)完成，取樣的動作要盡量快速利索,，將組織切成任一方向小于 0.5 cm 的薄片（盡可能剪碎）,，抽取 1ml trizol 溶液于 2ml凍存管內(nèi)，將樣本完全浸沒于trizol溶液(如0.4g樣本需要約2.0 mLtrizol的溶液),。

液氮速凍后,，-80 度保存。

注意：為完全有效的保護組織樣本,，該組織樣本應(yīng)完全浸沒入 trizol 溶液中并且組織樣本的任何一邊的最大厚度不應(yīng)超過 0.5 cm,。

2.細胞樣本

細胞收集后用PBS緩沖液快速洗一次，每5×10⁶個細胞加入1 ml trizol,，用槍頭反復(fù)抽打,，直至看不見成團的細胞塊，整個溶液呈清亮而不粘稠的狀態(tài),；液氮速凍,，-80 ℃保存。

3.血液樣本

1）加入1 ml TRIzol和 200-300μL新鮮血液（TRIzol：血液 = 3：1-5：1）,，用移液器吹打幾次以幫助裂解樣品中的細胞,；

2）樣品劇烈震蕩混勻1~2 min,，直到絮狀物全部溶解；

3）室溫孵育5 min以使核蛋白體完全分解,；

4）寫好編號,，封口膜封存，-80 ℃凍存,。

注意：冰凍血液溶解過程中會有破碎的細胞釋放RNA酶,，因此建議在冰凍前加入TRIzol，切勿直接凍存新鮮血液,，保存好的血液應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

運輸條件：干冰運輸

DNA提取

（1）組織樣本：取材后，PBS清洗2-3次,，液氮速凍,， -80 ℃保存

（2）細胞樣本：細胞收集沉淀后，液氮速凍,， -80 ℃保存

運輸條件：冰袋運輸

二,、蛋白實驗（WB/ELISA）

組織樣本：取新鮮組織，用無塵紙快速吸去血液,，將組織剪成小塊,，放入裝有液氮的錫箔紙中速凍后，放入液氮預(yù)冷的離心管中,，液氮速凍5min后,，-80度保存。

細胞樣本：收集細胞懸浮液于1.5ml的離心管中,，離心去上清,，PBS洗滌三次，液氮速凍5min后,，-80 ℃保存,。

血清樣品：收集全血，室溫放置2h,，4℃ 3000rpm/min 離心10min,，吸取上部的血清即可，-80度保存,。

運輸條件：干冰運輸

全血：新鮮抗凝血,，避免劇烈震蕩，避免凝血,；立即提取,。

三、病理實驗

1.    石蠟切片

組織樣本：取材后,，PBS 清洗 2-3 次,，使用 4%多聚甲醛固定,，組織樣本需完全浸泡在固定液中，固定液的容量應(yīng)足夠,，一般固定液與組織塊的體積比率應(yīng)大于 10:1,。室溫保存。

注意：取材樣本要新鮮,，否則細胞內(nèi)溶酶體會破裂,，造成細胞自融。

細胞樣本：細胞爬片后,，4%多聚甲醛固定30min,，換PBS浸沒4度保存。

運輸條件：常溫運輸

其他組織保存,、固定等

2.    冰凍切片

取新鮮組織，PBS清洗2-3次后,，立即用OCT包埋,，-80度固定/保存?；蛘咝迈r組織,，PBS清洗后，-80度保存,。

運輸條件：干冰運輸

其他染色保存,、固定等
 

3.透射電鏡樣本

3.1動物組織樣本

① 1-3min內(nèi)取樣，取樣組織2mmX2mm大小,，盡量薄,。如來不及修整組織大小可先于電鏡固定液內(nèi)固定半小時左右待組織變硬以后再修整組織進行后固定。超出此范圍后組織會無法完全固定,，后續(xù)實驗無法完成,，務(wù)必請重視此過程。

② 取材時盡量精確到需要觀察的目的部位（如觀察腎小球取腎皮質(zhì),；觀察胰島取胰島豐富的胰尾,；皮膚，腸胃等在固定液中易打卷的組織可將組織粘在濾紙上進行固定）,。

③ 取材時一定注意避免鑷子擠壓等機械損傷,，刀片要鋒利避免挫傷組織。

④ 組織取下后立即投入電鏡固定液內(nèi)室溫固定2h,，再轉(zhuǎn)移至4℃保存,，4℃冰袋運輸，在保存和運輸過程中固定液切勿冷凍結(jié)冰,。4℃時樣本可保存1個月左右,。

3.2細胞樣本

貼壁細胞：實驗?zāi)康闹攸c觀察細胞連接,，將培養(yǎng)好的細胞棄培養(yǎng)基不經(jīng)漂洗迅速加電鏡固定液用細胞刮沿一個方向輕輕刮下細胞收集到離心管內(nèi)（避免刮破細胞）。實驗?zāi)康闹攸c觀察細胞器,，對細胞形態(tài)形狀無特殊要求,，用胰酶消化，離心收集細胞要肉眼可見細胞沉淀芝麻至綠豆大小,，棄固定液后加新的電鏡固定液室溫固定2h,，再轉(zhuǎn)移至4℃保存，4℃冰袋運輸,，在保存和運輸過程中固定液切勿冷凍結(jié)冰,。

懸浮細胞：離心收集細胞要肉眼可見細胞沉淀芝麻至綠豆大小，棄培養(yǎng)基后加電鏡固定液室溫固定2h,，再轉(zhuǎn)移至4℃保存,，4℃冰袋運輸，在保存和運輸過程中固定液切勿冷凍結(jié)冰,。

四,、生化實驗

組織樣本：取新鮮組織，用PBS清洗去血液,，將組織剪成小塊,，放入凍存管中，液氮速凍5min后,， -80℃保存

血清樣本：全血標(biāo)本室溫放置2小時3000rpm/min離心15min,，-80℃保存。

血漿樣本:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2-8℃3000rpm/min離心15min,， -80℃保存。

細胞樣本:收集細胞沉淀,， -80℃保存

運輸條件：干冰運輸

小提示：

1.血清與血漿的區(qū)別

注意：血清血漿顏色外觀無差別,，不備注清楚無法肉眼分辨。

血清：全血中不加抗凝劑或加促凝劑,，血液凝固后取出的不含凝血因子的淡黃色透明液體,。

血漿：全血中加抗凝劑，血液凝固后取出的含凝血因子的淡黃色透明液體,。

區(qū)別1：取血清不加抗凝劑,；取血漿加抗凝劑。

區(qū)別2：血清中不含凝血因子,；血漿中含凝血因子

2.實驗用血清還是血漿

生化：建議優(yōu)先選擇血清,，其次選擇肝素抗凝血漿

ELISA：建議優(yōu)先選擇血清，其次選擇肝素或EDTA抗凝血漿

凝血實驗：只能選擇枸櫞酸鈉抗凝血漿

血常規(guī)：只能選擇EDTA抗凝全血

3. 不同抗凝劑對實驗檢測的影響

注意：有以下檢測指標(biāo)且需要用血漿的,，請選擇相應(yīng)的抗凝劑

生化：EDTA對無機離子,、堿性磷酸酶,、肌酸激酶、超氧化物歧化酶檢測有影響,；常規(guī)生化檢測可用肝素鋰抗凝血漿,。

ELISA：常規(guī)指標(biāo)血清或EDTA及肝素抗凝血漿都可測，凝血相關(guān)指標(biāo)需用枸櫞酸鈉抗凝,，以具體指標(biāo)為準(zhǔn),。

凝血四項：肝素及EDTA可能導(dǎo)致測不出來，只能用3.2%或3.8%枸櫞酸鈉抗凝：全血=1:9比例抗凝,。

血常規(guī)：肝素影響白細胞計數(shù),，其他抗凝或多或少影響血細胞形態(tài)，EDTA為最佳抗凝劑,，最佳濃度比為1.5mgEDTA：1ml全血