脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是由高能量創(chuàng)傷引起脊柱骨折或脫位而導(dǎo)致的脊髓神經(jīng)受損,， 是一種致殘致死率較高的疾病,。由于脊髓損傷后的病理、生理機(jī)制復(fù)雜,，目前治療效果尚不理想,，而要研究脊髓損傷機(jī)制及其治療方法，構(gòu)建動物脊髓損傷模型至關(guān)重要,。本文結(jié)合靈賦拓普生物大動物技術(shù)部豐富的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn),，分享比格犬脊髓損傷模型建立與藥物驗(yàn)證研究。

一,、實(shí)驗(yàn)材料
（1） 實(shí)驗(yàn)動物：比格犬,，10-14kg，雌性,；

（2） 實(shí)驗(yàn)藥品：舒泰50,，丙泊酚，異氟烷,，青霉素,，痛立定；

二,、實(shí)驗(yàn)方案

模型建立與藥物干預(yù)

比格犬通過肌肉注射舒泰50進(jìn)行麻醉,，行氣管插管，術(shù)中2%異氟烷進(jìn)行維持麻醉,。動物采用正中俯臥位,，固定四肢，對T10為中心的手術(shù)區(qū)域及周圍進(jìn)行備皮消毒,，鋪無菌中單,，依次切開皮膚,，筋膜，及韌帶,，剝離附著于脊柱的肌肉,，充分暴露椎板，然后進(jìn)行椎板切除,，暴露脊髓,，造成脊髓壓迫，同時(shí)保持壓迫10min,，形成重度脊髓損傷,。在局部止血后，縫合肌肉和皮膚,。等動物麻醉轉(zhuǎn)醒后單獨(dú)放入犬籠中,。受試組分別在術(shù)后D1，D3,，D5,，D7，進(jìn)行脊髓給藥治療干預(yù),。對照組無需干預(yù)治療,。

術(shù)后護(hù)理

術(shù)后每日傷口換藥護(hù)理持續(xù)7d，抗生素5d預(yù)防感染,，術(shù)后48h給予鎮(zhèn)痛藥,。若手術(shù)后出現(xiàn)食欲不振，適當(dāng)予以腸外營養(yǎng),，補(bǔ)充體液和能量,。

每日進(jìn)行大體狀況檢查，若出現(xiàn)排尿困難,，則需要每天進(jìn)行腹部按摩,，促進(jìn)排尿。必要時(shí)進(jìn)行尿道留置導(dǎo)尿管,。若出現(xiàn)便秘,，排便困難等情況，則需要飼喂易消化的食物,，必要時(shí)進(jìn)行通便,。其他臨床癥狀，積極對癥治療,。

常規(guī)臨床體征觀察,，造模后每日觀察其運(yùn)動狀態(tài)、后肢有無疼痛放射、有無食欲,、精神狀態(tài),、能否自主排尿、排便等臨床體征,，并做好記錄,。

三、模型評估

行為學(xué)評估

1) 步態(tài)評分標(biāo)準(zhǔn)

手術(shù)造模之前及PB-NPs干預(yù)之后于第1周,，第2周,，第3周，第5周,，第8周，固定時(shí)間進(jìn)行行為學(xué)評分,，共計(jì)6次步態(tài)評分,，每次保留原始實(shí)驗(yàn)記錄，及視頻,。每次評分時(shí)間為10分鐘/動物,。每次3人獨(dú)立評分。

2) 本體感覺評價(jià)

將犬胸腹托起的同時(shí)把前肢或爪的背面輕輕地放在不滑的地面上,。假如他們能立即恢 復(fù)肢體則視作正常評分為2,；將爪復(fù)位但能看到一個(gè)時(shí)間延長期或很困難的做這樣被視作反應(yīng)遲鈍評分為1；沒有反應(yīng)的評分為0,。 

3) 傷害險(xiǎn)知覺評價(jià)

淺感覺可以通過刺激腳蹼來評價(jià),，深感覺可以通過刺激腳趾來評價(jià)。

4) 排尿功能評價(jià)

觀察排尿情況：若有自主排尿,，記錄頻次,、每日尿量；若無自主排尿,，則需觀察排尿異常類型（尿潴留,、尿失禁等），根據(jù)人工輔助排尿（手法排尿或?qū)颍┣闆r記錄每日的頻次及尿量,。此外每日還需觀察有無血尿,、膿尿等情況并對癥處理。

影像學(xué)評價(jià)

造模前1d和造模后1d,、20d,、56d，安排MRI檢測,， T1/T2序列掃描受損部位+泌尿系統(tǒng)（MRU：腎臟,、膀胱、輸尿管），觀察脊髓硬膜內(nèi)外的結(jié)構(gòu)變化,、神經(jīng)水腫以及泌尿系統(tǒng)形態(tài),，術(shù)后20天和術(shù)后56天觀察瘢痕情況。

手術(shù)造模之前及手術(shù)后1w,，2w,，3w，5w,，8w各一次進(jìn)行腹部超聲檢測,，測量膀胱大小及殘余尿量等；各行一次尿流動力學(xué)檢查,，評價(jià)膀胱排尿功能（包括最大膀胱容量,、膀胱最大排尿壓力、膀胱漏尿點(diǎn)壓及膀胱順應(yīng)性等）,。

1）電信號采集

造模前1d和造模后1d,、20d、56d,，進(jìn)行肌電波檢測1次,，通過保定器固定，對四肢進(jìn)行電刺激（3mA,、5mA,、7mA），記錄肌電信號,，評估造模效果,。

2）血液學(xué)檢查

造模前1d和造模后1d、7d,、28d,、56d，采集5ml血液（非麻醉狀態(tài)）進(jìn)行血生化,、血常規(guī)檢測,。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每只動物再取2ml無抗凝全血,，分離血清,，分別用凍存管凍存在液氮用于后期疾病biomarker分析。

3）病理組織切片

同一只動物身上取受損處脊髓,，未損傷處脊髓,，腎臟+輸尿管+膀胱各2份樣本，其中一份用福爾馬林固定,，每份樣本各做橫切,，縱切兩片切片，分析同一只動物之間受損與未受損脊髓之間的差異，和分析不同動物組別之間受損脊髓之間差異,。評估藥物干預(yù)對脊髓修復(fù)的差異,。

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