細(xì)胞轉(zhuǎn)染的基本原理是將外源的DNA克隆到載體上后導(dǎo)入細(xì)胞,,借助宿主細(xì)胞表達(dá)載體上的目的片段,,從而使目的基因在細(xì)胞中發(fā)揮功能。目前轉(zhuǎn)染方法有多種,,如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,、磷酸鈣-DNA共沉淀法、電穿孔轉(zhuǎn)染法,、腺病毒感染等,。
常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類,一類是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,,另一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的外源DNA不整合到宿主的染色體中,通常表達(dá)只持續(xù)幾天,,一般在轉(zhuǎn)染24-72小時(shí)后檢測(cè),。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的外源DNA將整合到宿主染色體中,可持續(xù)性表達(dá),,一般用于穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建,。
服務(wù)內(nèi)容
l 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(瞬轉(zhuǎn))
1.載體構(gòu)建(可選),RNAi合成(視轉(zhuǎn)染情況而定),;
2.將細(xì)胞按照1~3x105接種到6孔板中,,加入2~4mL的完全培養(yǎng)基,混勻放置在二氧化碳培養(yǎng)中,,37℃過夜,;
3.無菌狀態(tài)下配置如下液體:
a.用100μL的Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋2μg的待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,;
b.用100μL的Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋25μL的Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑;
4.將a, b液混合并混勻,,室溫放置15min,;
5.細(xì)胞培養(yǎng)至80%單層左右,用Opti-MEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次,,每孔加入1mL Opti-MEM培養(yǎng)基,,并將混合后的ab溶液逐滴加入到每孔中,按十字方向輕搖混勻,,二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),;
6. 4-6小時(shí)后將轉(zhuǎn)染液吸出,換為新的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),,培養(yǎng)3-4天后檢測(cè)蛋白表達(dá)量,。
l 腺病毒轉(zhuǎn)染(瞬轉(zhuǎn))
1.腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建;
2.以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法包裝腺病毒,,測(cè)其滴度,;
3.不同MOI下測(cè)試得最佳轉(zhuǎn)染效率值;
4.使用最佳MOI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,。
l 慢病毒轉(zhuǎn)染(穩(wěn)轉(zhuǎn))
1.慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建,;
2.以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法包裝慢病毒,測(cè)其滴度,;
3.不同MOI下測(cè)試得最佳轉(zhuǎn)染效率值,;
4.使用最佳MOI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染;
5.進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選,。