腦膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長,，邊界不清,，惡性程度高，手術(shù)不能完全切除,，且由于血腦屏障的存在導(dǎo)致化療效果不佳,，同時對放療不敏感，故患者多數(shù)預(yù)后較差,，5年生存率不超過5%,，術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，患者平均生存時間僅一年左右,。為研究腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制,，必須建立一種穩(wěn)定、良好的腦膠質(zhì)瘤動物模型,。

目前建立腦膠質(zhì)瘤動物模型的方法主要有誘發(fā)型,、移植型和轉(zhuǎn)基因型三類：(1)誘發(fā)型：包括化學(xué)物質(zhì)誘發(fā)和病毒誘發(fā),，此類動物模型的生物學(xué)特征不穩(wěn)定，且針對某些特殊病毒性腫瘤會表現(xiàn)出很強的免疫原性,，故實際應(yīng)用存在局限性,；(2)轉(zhuǎn)基因型：此類動物模型的生物學(xué)特征不穩(wěn)定，來源有限,，且實驗成本高,；(3) 移植型：移植瘤株存活性高且易于保存，動物模型易建立,，生物學(xué)特性與人腦膠質(zhì)瘤最為接近,，實驗成本低廉，是目前建立最多,、研究最廣泛的膠質(zhì)瘤模型,。

一、移植型腦膠質(zhì)瘤模型

建立移植型的腦膠質(zhì)瘤模型通常選用C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞,，該細(xì)胞：(1)同時具備膠質(zhì)瘤細(xì)胞和惡性細(xì)胞生物特性,；(2)組織相容性強，與各種大鼠均能配適,；(3)在大鼠腦內(nèi)接種后腫瘤形成時間短,，成活率較高，生存期較穩(wěn)定; (4)生物學(xué)特性與人腦膠質(zhì)瘤較為接近,，有浸潤性生長,、新生血管形成的特性，建立模型的瘤體特征及生長方式更接近于人腦惡性膠質(zhì),，呈現(xiàn)多形性,、高有絲分裂指數(shù)、瘤內(nèi)局灶壞死出血,、腦實質(zhì)浸潤,、腫瘤血管豐富且無包膜的特點，適合用來研究腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制和治療方法,。

細(xì)胞培養(yǎng)：

取C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞2×10?個,，置于DMEM高糖培養(yǎng)基(含10% FBS、100 U /mL青霉素和100 μg /mL鏈霉素)進(jìn)行傳代連續(xù)培養(yǎng),。培養(yǎng)48 h,，細(xì)胞融合80%-90%時，加入0.25%胰蛋白酶消化,。倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮變圓,，且有個別細(xì)胞脫落時加入完全培養(yǎng)基終止消化。臺盼藍(lán)排斥試驗檢測細(xì)胞活力,，C6存活率應(yīng)＞90%

注意：若細(xì)胞活性差,，則需再次培養(yǎng),，直至檢測活性符合造模需要為止。1000 r /min離心3-4 min,，收集細(xì)胞,，用無血清培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞懸液，采用血球計數(shù)板計數(shù),，將單細(xì)胞懸液密度調(diào)整為1 × 10?個/10 μL,，置于37 ℃恒溫振蕩水浴中存放待用(目的：避免由于細(xì)胞死亡和沉底造成細(xì)胞密度不均勻)，盡量在短時間內(nèi)(注意：不超過90 min) 接種,。

二,、腦膠質(zhì)瘤模型造模方法

動物品系：SPF級SD大鼠，健康,，6~8W,，雄性，體重為180g-200g,；

實驗分組：正常對照組,、模型組；

實驗周期：4-6 weeks,；

實驗應(yīng)用：用于研究腦膠質(zhì)瘤引起的腦部損傷,；

造模方法 

(1)大鼠稱重后以1.25％阿佛丁（三溴乙醇）按10ml/kg體重腹腔麻醉,，麻醉成功后剃除顱頂部毛發(fā),，取俯臥位，將動物頭部固定于腦立體定位儀上,，保持顱頂水平位置,；

圖注：拓普生物腦立體定位儀

(2)手術(shù)區(qū)常規(guī)消毒，沿顱頂正中矢狀線縱向切開長約2cm皮膚,，分離暴露顱骨,；

(3)鈍性分離肌肉及骨膜，雙氧水消毒及止血,，在距前囪正中線前6mm、中線旁開2~3cm處,，用5mL注射器針頭鉆孔,不可傷及硬腦膜,；

(4-1)30 μL微量注射器抽吸25μL單細(xì)胞懸液，針尖調(diào)節(jié)至觸及硬腦膜,，沿骨孔緩慢垂直進(jìn)針至硬腦膜下5.5 mm,，退針1 mm后固定(目的：創(chuàng)建一個細(xì)胞懸液暫時存儲空間，并防止其沿針道擴散),；

(4-2)緩慢將細(xì)胞懸液注入尾狀核內(nèi)(注意：如果太快會引起細(xì)胞懸浮液從腦內(nèi)溢出,，沿腦脊液播散,，導(dǎo)致種植細(xì)胞數(shù)減少，腫瘤難以成長為實體瘤,，或細(xì)胞在頭皮下生長,，造模失敗)，注射時間為10 min(1 μL /min),，注射完畢后留針5 -10min(目的：留針可防止腫瘤細(xì)胞溢出,，有利于瘤細(xì)胞沉積在穿刺道的底部，減少因虹吸效應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞沿注射針回流出腦外,，并延長腫瘤細(xì)胞與靶點腦組織的接觸時間,，從而提高成瘤率；同時有利于腦組織適應(yīng)局部的壓力增高,，減少瘤細(xì)胞沿針道種植轉(zhuǎn)移),，緩慢拔針(目的：防止接種細(xì)胞的反流)，骨孔用骨蠟密封??；

(5)逐層縫合皮膚，生理鹽水沖洗術(shù)野,，噴灑適量抗生素,，縫合皮膚，切口消毒,，放入保暖箱內(nèi),。大鼠麻醉蘇醒后放回飼養(yǎng)箱飼養(yǎng)并觀察。

三,、術(shù)后檢測

1,、一般情況：

（1）正常組生長狀況良好，活動,、飲食均正常,；

（2）模型組接種后隨著時間延長，前期大鼠進(jìn)食逐漸減少,，體重逐漸下降,，眼周有出血癥狀，中期甚或出現(xiàn)眼周瘀血,，精神逐漸萎靡,、反應(yīng)遲鈍、腹瀉,，后期上述癥狀明顯加重,，皮毛失去光澤，部分出現(xiàn)偏癱,、昏迷,，甚至死亡,。

2、全腦標(biāo)本觀察：

可在腫瘤細(xì)胞種植后至實驗結(jié)束前分時間點獲取全腦標(biāo)本,，以測量膠質(zhì)瘤大體標(biāo)本的體積,，按腦表面的接種穿刺點作一冠狀交叉切口，觀察腫瘤生長情況并計算腫瘤體積= a×b×c(a為腫瘤的最大徑,，b為與最大徑垂直的最寬徑,，c為腫瘤的高) ；

模型組大腦左側(cè)腫瘤浸潤性生長,，較周圍正常組織顏色深,，腦中線向右偏，占位效應(yīng)明顯,，切面可見腫瘤內(nèi)出血和組織壞死,。隨著建模時間的延長，腫瘤的體積會不斷增加,。

 圖注：正常組腦中線居中（左）與模型組占位引起腦中線偏移（右）

3,、HE染色(蘇木精-伊紅染色)：

模型組腦組織HE染色后可見腫瘤細(xì)胞呈橢圓形，核大深染,，核分裂相多見,，圍繞血管生長活躍，排列紊亂,，腫瘤組織內(nèi)有出血和壞死區(qū)域,，伴有豐富的膨脹的微血管，微血管內(nèi)充斥著大量的紅細(xì)胞,，并被壞死區(qū)域包圍,。

圖注：C6腦膠質(zhì)瘤傾向圍繞血管生長

 圖注：C6腦膠質(zhì)瘤接種后7天、14天,、21天

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