一,、取材

動(dòng)物麻醉后,，解剖迅速取出所需的新鮮組織,，立刻轉(zhuǎn)到固定液中固定,，此步應(yīng)盡可能快速完成,，防止組織暴露在外因此后續(xù)檢測(cè)結(jié)果。

二,、脫水

固定好的組織,，轉(zhuǎn)到15%蔗糖中脫水至沉底，再轉(zhuǎn)到30%蔗糖中沉底即可,。注意：所用的固定液和脫水劑均是用PBS緩沖液來配制,，如果不是，會(huì)破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu),。

三,、速凍

1、將組織塊平放于冰凍切片塑料模具內(nèi),，緩緩加入包埋劑OCT到模具內(nèi),，避免引起氣泡。注意：需要切片的位置放到模具底部,。

另外值得注意的是：一般在進(jìn)行速凍之前,，先用包埋劑浸沒組織1-2h，然后再進(jìn)行速凍,。

2,、用夾子夾住包埋好的組織放到液氮中，此時(shí)開始?xì)饣序v,。注意：包埋模具切勿浸入液氮中,，大約10-20s組織即迅速冰結(jié)成塊。

注：要防止冰晶的產(chǎn)生,，就是要控制組織的速凍過程,，水的物理性質(zhì)可知，水在-4度的時(shí)候,，體積最大,，這就說明了，如果水在-4度的停留時(shí)間越長,，組織體內(nèi)的冰晶體積就越大,，數(shù)量就越多。因此,，我們要做好冰凍切片,，防止組織出現(xiàn)空泡，就是要在速凍過程中,，減少水停留在-4的的時(shí)間,。

3,、制成凍塊后，即可置入恒冷凍切片機(jī)進(jìn)行切片,。備注：若需要保存,，應(yīng)快速以鋁箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/span>

4,、托臺(tái)上涂一層OCT包埋膠,，將速凍好的組織置于涂好OCT的托臺(tái)上，放上鐵壓臺(tái),，利用重力壓平組織,。

四、切片

1,、把冷凍好的組織承載器裝到儀器的進(jìn)退鍵上,，手工旋轉(zhuǎn)旋鈕，觀察是否固定好,。

2,、調(diào)好切片厚度，修片,，修到需要的位置再切,，恒溫冰凍切片機(jī)為較理想的冰凍切片機(jī)，切片機(jī)置于低溫密閉室內(nèi),，切片時(shí)不受外界溫度和環(huán)境影響,，可連續(xù)切薄片至5-20μm，一般切10um既可,。

3,、切片時(shí)，低溫室內(nèi)溫度以-15℃ ~ -22℃為宜,，溫度過低組織易破碎,，抗卷板的位置及角度要適當(dāng)，載玻片附貼組織切片,，切勿上下移動(dòng),。

注意：包埋劑的選擇，包埋劑是對(duì)冰凍切片的質(zhì)粒是一個(gè)重要的影響因素,，常規(guī)的包埋劑有OCT劑,，B超耦合劑和普通的膠水；其中B超耦合劑適用于細(xì)胞豐富質(zhì)地較嫩的組織,，普通膠水和OCT劑適用于纖維豐富質(zhì)地偏硬的組織,。

五、冰凍切片的注意事項(xiàng)
       (1) 速凍：是冰凍切片的關(guān)鍵,，因?yàn)橹挥兴賰霾拍軠p少組織內(nèi)的冰晶,，最好的辦法是將速凍頭壓在組織上,，凍好后就可切片。特別適用于較脆的組織,。而含有脂肪較多的組織,，最放放在液氮里處理。在液氮里冷凍要注意不要凍過頭,，2～3秒鐘就要拿出來看一下,，只要有4/5的組織已經(jīng)凍住就可以了，待冷凍頭拿出后剛好全部凍住,，否則就會(huì)引起組織發(fā)脆，或冷凍頭與組織分離 [醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)整理發(fā)布],。
        (2)固定：切片后應(yīng)立即放入甲醇中固定,，不能等切片干后再固定，后者容易造成細(xì)胞退變,。一般來說甲醇作用快,，收縮小，染色較清晰,，是冰凍切片最理想的固定液,。

注意: 此步是針對(duì)新鮮組織冰凍切片的固定方法。
       (3)包埋劑：一般用OCT包埋劑即可,，也可用普通膠水代替,，但要加入適量的水（膠水與水的比例大約在2：1左右）。太稀容易損傷切片刀,；太稠會(huì)粘在切片上不容易洗掉,影響切片的質(zhì)量,。
        (4)冰凍用切片刀每次要用新的刀片，刀片的質(zhì)量是影響冰凍切片的關(guān)鍵,。

        (5)如果組織發(fā)脆,，一般是冷凍過久則可等幾分鐘后再切，也可用手在組織上稍稍加溫,。
       (6)冷凍室的溫度冬天一般設(shè)在-19℃左右,，夏天設(shè)在-22℃左右。不同的組織,有不同的溫度要求:肝臟,、甲狀腺組織溫度控制在-15℃左右,，脂肪組織一般在-35℃以下。
       (7) 冷凍切片機(jī)應(yīng)長期處于恒溫冷凍狀態(tài),，經(jīng)常的開關(guān)機(jī)器電源容易造成壓縮機(jī)損傷,。

表1 石蠟切片與冰凍切片的優(yōu)缺點(diǎn)比較


表2 不同溫度下各新鮮組織冷凍頭和冷凍箱的溫度

一般方法做的冰凍切片有如下的空泡（冰晶形成的結(jié)果）

結(jié)果展示