科研狗做了一天的實驗,，本來高高興興,。

實驗試劑，復(fù)核,，完美,！

實驗步驟,，復(fù)核，完美,！

實驗儀器,，復(fù)核，也完美,！

但~~

難道,，這就是傳說中的水逆！,？

科研狗都知道水逆是個玄學(xué),，但有時候水逆寶寶表示

那么到底是哪里出了問題呢？其實有時候我們在取樣和樣本保存的時候,，一些細(xì)節(jié)問題沒注意到,，那么就會導(dǎo)致整個實驗所有的努力白費。特別是一些剛進(jìn)實驗室的熊孩子們,，一頓操作猛如虎,，一看結(jié)果全是哭！

好了,，好了,，小拓今天就來整理一下，一些常規(guī)實驗樣本保存方法及注意事項,，包括：分子實驗,、蛋白實驗、病理實驗,、透射電鏡、生化檢測,。

一,、分子實驗（RNA/DNA）

RNA提取（QPCR/測序等）

1.組織樣本

組織取材在組織離體 30min 內(nèi)完成,，取樣的動作要盡量快速利索,，將組織切成任一方向小于 0.5 cm 的薄片（盡可能剪碎），抽取 1ml trizol 溶液于 2ml凍存管內(nèi),，將樣本完全浸沒于trizol溶液(如0.4g樣本需要約2.0 mLtrizol的溶液),。

液氮速凍后，-80 度保存,。

注意：為完全有效的保護(hù)組織樣本,，該組織樣本應(yīng)完全浸沒入 trizol 溶液中并且組織樣本的任何一邊的最大厚度不應(yīng)超過 0.5 cm。

2.細(xì)胞樣本

細(xì)胞收集后用PBS緩沖液快速洗一次,，每5×10⁶個細(xì)胞加入1 ml trizol,，用槍頭反復(fù)抽打,，直至看不見成團(tuán)的細(xì)胞塊，整個溶液呈清亮而不粘稠的狀態(tài),；液氮速凍,，-80 ℃保存。

3.血液樣本

1）加入1 ml TRIzol和 200-300μL新鮮血液（TRIzol：血液 = 3：1-5：1）,，用移液器吹打幾次以幫助裂解樣品中的細(xì)胞,；

2）樣品劇烈震蕩混勻1~2 min，直到絮狀物全部溶解,；

3）室溫孵育5 min以使核蛋白體完全分解,；

4）寫好編號，封口膜封存,，-80 ℃凍存,。

注意：冰凍血液溶解過程中會有破碎的細(xì)胞釋放RNA酶，因此建議在冰凍前加入TRIzol,，切勿直接凍存新鮮血液,，保存好的血液應(yīng)避免反復(fù)凍融。

運輸條件：干冰運輸

DNA提取

（1）組織樣本：取材后,，PBS清洗2-3次,，液氮速凍， -80 ℃保存

（2）細(xì)胞樣本：細(xì)胞收集沉淀后,，液氮速凍,， -80 ℃保存

運輸條件：冰袋運輸

二、蛋白實驗（WB/ELISA）

組織樣本：取新鮮組織,，用無塵紙快速吸去血液,，將組織剪成小塊，放入裝有液氮的錫箔紙中速凍后,，放入液氮預(yù)冷的離心管中,，液氮速凍5min后，-80度保存,。

細(xì)胞樣本：收集細(xì)胞懸浮液于1.5ml的離心管中,，離心去上清，PBS洗滌三次,，液氮速凍5min后,，-80 ℃保存。

血清樣品：收集全血,，室溫放置2h,，4℃ 3000rpm/min 離心10min，吸取上部的血清即可,，-80度保存,。

運輸條件：干冰運輸

全血：新鮮抗凝血,，避免劇烈震蕩，避免凝血,；立即提取,。

三、病理實驗

1.    石蠟切片

組織樣本：取材后,，PBS 清洗 2-3 次,，使用 4%多聚甲醛固定，組織樣本需完全浸泡在固定液中,，固定液的容量應(yīng)足夠,，一般固定液與組織塊的體積比率應(yīng)大于 10:1。室溫保存,。

注意：取材樣本要新鮮,，否則細(xì)胞內(nèi)溶酶體會破裂，造成細(xì)胞自融,。

細(xì)胞樣本：細(xì)胞爬片后,，4%多聚甲醛固定30min，換PBS浸沒4度保存,。

運輸條件：常溫運輸

其他組織保存,、固定等

2.    冰凍切片

取新鮮組織，PBS清洗2-3次后,，立即用OCT包埋,，-80度固定/保存?；蛘咝迈r組織,，PBS清洗后，-80度保存,。

運輸條件：干冰運輸

其他染色保存,、固定等
 

3.透射電鏡樣本

3.1動物組織樣本

① 1-3min內(nèi)取樣，取樣組織2mmX2mm大小,，盡量薄。如來不及修整組織大小可先于電鏡固定液內(nèi)固定半小時左右待組織變硬以后再修整組織進(jìn)行后固定,。超出此范圍后組織會無法完全固定,，后續(xù)實驗無法完成，務(wù)必請重視此過程,。

② 取材時盡量精確到需要觀察的目的部位（如觀察腎小球取腎皮質(zhì),；觀察胰島取胰島豐富的胰尾；皮膚,，腸胃等在固定液中易打卷的組織可將組織粘在濾紙上進(jìn)行固定）,。

③ 取材時一定注意避免鑷子擠壓等機(jī)械損傷,，刀片要鋒利避免挫傷組織。

④ 組織取下后立即投入電鏡固定液內(nèi)室溫固定2h,，再轉(zhuǎn)移至4℃保存,，4℃冰袋運輸，在保存和運輸過程中固定液切勿冷凍結(jié)冰,。4℃時樣本可保存1個月左右,。

3.2細(xì)胞樣本

貼壁細(xì)胞：實驗?zāi)康闹攸c觀察細(xì)胞連接，將培養(yǎng)好的細(xì)胞棄培養(yǎng)基不經(jīng)漂洗迅速加電鏡固定液用細(xì)胞刮沿一個方向輕輕刮下細(xì)胞收集到離心管內(nèi)（避免刮破細(xì)胞）,。實驗?zāi)康闹攸c觀察細(xì)胞器,，對細(xì)胞形態(tài)形狀無特殊要求，用胰酶消化,，離心收集細(xì)胞要肉眼可見細(xì)胞沉淀芝麻至綠豆大小,，棄固定液后加新的電鏡固定液室溫固定2h，再轉(zhuǎn)移至4℃保存,，4℃冰袋運輸,，在保存和運輸過程中固定液切勿冷凍結(jié)冰。

懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞要肉眼可見細(xì)胞沉淀芝麻至綠豆大小,，棄培養(yǎng)基后加電鏡固定液室溫固定2h,，再轉(zhuǎn)移至4℃保存，4℃冰袋運輸,，在保存和運輸過程中固定液切勿冷凍結(jié)冰,。

四、生化實驗

組織樣本：取新鮮組織,，用PBS清洗去血液,，將組織剪成小塊，放入凍存管中,，液氮速凍5min后,， -80℃保存

血清樣本：全血標(biāo)本室溫放置2小時3000rpm/min離心15min，-80℃保存,。

血漿樣本:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2-8℃3000rpm/min離心15min， -80℃保存,。

細(xì)胞樣本:收集細(xì)胞沉淀,， -80℃保存

運輸條件：干冰運輸

小提示：

1.血清與血漿的區(qū)別

注意：血清血漿顏色外觀無差別，不備注清楚無法肉眼分辨,。

血清：全血中不加抗凝劑或加促凝劑,，血液凝固后取出的不含凝血因子的淡黃色透明液體。

血漿：全血中加抗凝劑,，血液凝固后取出的含凝血因子的淡黃色透明液體,。

區(qū)別1：取血清不加抗凝劑,；取血漿加抗凝劑。

區(qū)別2：血清中不含凝血因子,；血漿中含凝血因子

2.實驗用血清還是血漿

生化：建議優(yōu)先選擇血清,，其次選擇肝素抗凝血漿

ELISA：建議優(yōu)先選擇血清，其次選擇肝素或EDTA抗凝血漿

凝血實驗：只能選擇枸櫞酸鈉抗凝血漿

血常規(guī)：只能選擇EDTA抗凝全血

3. 不同抗凝劑對實驗檢測的影響

注意：有以下檢測指標(biāo)且需要用血漿的,，請選擇相應(yīng)的抗凝劑

生化：EDTA對無機(jī)離子,、堿性磷酸酶、肌酸激酶,、超氧化物歧化酶檢測有影響,；常規(guī)生化檢測可用肝素鋰抗凝血漿。

ELISA：常規(guī)指標(biāo)血清或EDTA及肝素抗凝血漿都可測,，凝血相關(guān)指標(biāo)需用枸櫞酸鈉抗凝,，以具體指標(biāo)為準(zhǔn)。

凝血四項：肝素及EDTA可能導(dǎo)致測不出來,，只能用3.2%或3.8%枸櫞酸鈉抗凝：全血=1:9比例抗凝,。

血常規(guī)：肝素影響白細(xì)胞計數(shù)，其他抗凝或多或少影響血細(xì)胞形態(tài),，EDTA為最佳抗凝劑,，最佳濃度比為1.5mgEDTA：1ml全血