消化酶選擇全攻略：胰酶/膠原酶/Accutase對(duì)比+原代/傳代實(shí)操指南
在細(xì)胞培養(yǎng)的微觀世界里,，消化酶如同精準(zhǔn)的 “細(xì)胞解讀者”,，肩負(fù)著分離貼壁細(xì)胞、拆解組織屏障的關(guān)鍵使命,。今天,，我們就來(lái)深入探討三種主流消化酶的特性與應(yīng)用，助你在實(shí)驗(yàn)中精準(zhǔn)選擇 “得力助手”,。
作為絲氨酸蛋白酶家族的代表，胰蛋白酶憑借對(duì)賴氨酸,、精氨酸肽鍵的切割能力,，成為貼壁細(xì)胞傳代的經(jīng)典之選。它通過(guò)水解細(xì)胞表面黏附蛋白（如層粘連蛋白）瓦解細(xì)胞間連接,，搭配 EDTA 螯合鈣鎂離子,，可顯著提升消化效率。 核心應(yīng)用 注意事項(xiàng) *0.25%胰酶-0.02% EDTA消化HuH-7(人肝癌細(xì)胞）,，消化前中后的照片,。 圖1：消化前（細(xì)胞貼壁，緊緊挨著） 圖2：消化中（可以看到類似藕斷絲連的現(xiàn)象） 圖3：消化后（細(xì)胞脫落,，漂浮,，聚團(tuán)） 源自溶組織梭狀芽孢桿菌的膠原酶,，是破解結(jié)締組織的 “專業(yè)選手”,。它靶向水解膠原蛋白肽鍵,，對(duì)細(xì)胞損傷極小,，尤其適合纖維性組織,、上皮及癌組織的分離,。根據(jù)組織硬度差異,，膠原酶分為多種類型： Ⅰ型膠原酶：用于較硬組織（如肝臟、腫瘤組織）,。用于上皮,、肺，脂肪和腎上腺組織細(xì)胞的分離,。用于消化組織中連接部分使其成為單個(gè)細(xì) 胞,，用于哺乳動(dòng)細(xì)胞的分離。 Ⅱ型膠原酶：適用于胰腺,、心臟,，肝臟，骨,，甲狀腺,，和唾液腺組織細(xì)胞的分離 Ⅲ型膠原酶：對(duì)所有哺乳動(dòng)物組織均有消化作用 Ⅳ型膠原酶：包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等,。更溫和,，用于原代細(xì)胞分離（如內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞）,。 濃度：0.1-2 mg/mL,，根據(jù)組織類型調(diào)整。 Ⅴ型膠原酶：包含至少7種蛋白酶成分,，分子量從68-130KD不等,。它可用于胰腺小島組織的分離，將結(jié)締組織分離成單個(gè)細(xì)胞,。 ? 不受鈣鎂離子及血清影響 應(yīng)用舉例：不同酶消化法提取豬原代肝細(xì)胞的效果比較（南京大學(xué)） 周徐倩,，董磊* （南京大學(xué)，江蘇 南京 210023） 不同酶消化法提取豬原代肝細(xì)胞的效果比較[J]．現(xiàn)代畜牧科技,，2024,，107（4）：53-55． doi：10.19369/j.cnki.2095-9737.2024.04.014． 上述文獻(xiàn)采用離體酶消化法，比較胰蛋白酶,、II型膠原酶,、IV型膠原酶、II型和IV型膠原酶混合物提取豬原代肝細(xì)胞的效果,。結(jié)果顯示,，這4種酶消化法均能獲得有功能的肝細(xì)胞，其中膠原酶混合物分離的肝細(xì)胞數(shù)量最多,，胰蛋白酶法分離的肝細(xì)胞數(shù)量較少,，II型,、IV型膠原酶消化法分離的肝細(xì)胞排列整齊、邊界清晰,。 需要注意的是,，無(wú)論使用何種酶消化，均需要精細(xì)地控制酶的用量,、消化時(shí)間和溫度,，避免因消化不充分或過(guò)度消化影響細(xì)胞的得率和活性。 這款由蛋白酶,、膠原酶等組成的混合酶液，堪稱細(xì)胞消化界的 “多面手”,。其溫和特性尤其適合干細(xì)胞,、原代細(xì)胞及表面標(biāo)志物檢測(cè)場(chǎng)景，無(wú)需血清中和即可直接離心,，大幅簡(jiǎn)化操作流程,。 使用注意：不要在溫水浴中解凍本品,。 Accutase對(duì)37 °C以上溫度敏感,，在37 °C下45分鐘后會(huì)失活。建議放在冰箱中過(guò)夜解凍,，或放在一盆冷的自來(lái)水中解凍1-1.5小時(shí),。 Accutase解凍后，搖動(dòng)瓶子使溶液混勻,。本品無(wú)需在使用前加熱,。從冰箱中取出后應(yīng)立即使用，用完后放回冰箱,。 Accutase融化后4℃保存,，至少2個(gè)月穩(wěn)定。不可室溫保存,。也可分裝成單次用量,，放到-80 ℃凍存，有效期2年。 1）適用于絕大多數(shù)原代細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的消化,，以及昆蟲(chóng)細(xì)胞； 2）溫和有效的消化,，凍存后細(xì)胞具更高復(fù)蘇率,； 3）幾分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)粘附細(xì)胞的分離，不需清洗或中和反應(yīng),，節(jié)省細(xì)胞傳代時(shí)間,； 4）對(duì)細(xì)胞消化較為溫和，能增加細(xì)胞產(chǎn)量和存活率,；增強(qiáng)細(xì)胞貼壁效率,；改善細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞生長(zhǎng)特性等。 Accutase與胰酶Trypsin在流式檢測(cè) 消化細(xì)胞上的應(yīng)用對(duì)比 流式檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示：凋亡率顯著低于傳統(tǒng)胰酶（見(jiàn)上圖）,。 截圖文獻(xiàn)：Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ ＰＩ 法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的影響因素. ＤＯＩ：１０． １６５１９／ ｊ． ｃｎｋｉ． １００４?３１１ｘ． ２０２２． ０６． ０１１２ 上述細(xì)胞凋亡流式檢測(cè)圖可以看到：對(duì)于未處理細(xì)胞而言,，與無(wú)EDTA 胰酶相比，Accutase能顯著減少凋亡率(２.70％ ｖｓ 18.05％）,；而經(jīng)藥物處理的細(xì)胞,，Accutase組凋亡率也有一定程度減少（22.32％ ｖｓ26.50％），但差異沒(méi)有未處理細(xì)胞大,。但都可以看出使用Acuutase處理需要流式檢測(cè)的細(xì)胞,，優(yōu)勢(shì)是很明顯的。 細(xì)胞培養(yǎng)中常用的消化酶還有中性蛋白酶,，分散酶,，透明質(zhì)酸酶等多種，在此就不再一一展開(kāi)介紹了,。下面總結(jié)一下常用消化酶的選擇依據(jù)： 1. 細(xì)胞類型： - 常規(guī)傳代細(xì)胞：胰蛋白酶,。 - 原代細(xì)胞或干細(xì)胞：膠原酶、Accutase,。 2. 組織硬度： -堅(jiān)硬組織（腫瘤,、肝臟）：Ⅰ型膠原酶。 -柔軟組織（腦,、胚胎）：分散酶,。 3. 實(shí)驗(yàn)需求： -需保留表面標(biāo)志物：分散酶或Accutase。 -快速消化：胰酶+EDTA,。
?適用細(xì)胞：HEK293,、HeLa 等常規(guī)貼壁細(xì)胞,。
?使用濃度：0.05%-0.25%（推薦 0.25% 胰酶 + 0.02% EDTA）。
?操作要點(diǎn)：37℃孵育 1-5 分鐘,，需用含血清培養(yǎng)基中和殘留酶活性,。
?? 消化時(shí)間需嚴(yán)格把控，避免細(xì)胞膜功能蛋白損傷
?? 消化過(guò)程呈現(xiàn) “從貼壁到懸浮” 的典型變化（見(jiàn)圖 1-3）
? 可與透明質(zhì)酸酶聯(lián)用增強(qiáng)效果
? 肝細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)顯示：膠原酶混合物得率與成活率雙高（見(jiàn)下圖）
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