親和力是評(píng)價(jià)可逆反應(yīng)過(guò)程中兩個(gè)分子間相互作用強(qiáng)弱的特征參數(shù),，是了解分子以及識(shí)別生物學(xué)過(guò)程,、藥物的發(fā)現(xiàn)與篩選等的重要指標(biāo)。蛋白質(zhì)相互作用/親和力檢測(cè)可應(yīng)用于藥物早期研究開(kāi)發(fā),、篩選鑒定,、臨床前與臨床研究以及下游生產(chǎn)質(zhì)控等各個(gè)環(huán)節(jié),，而且在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究,、生物制藥開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用,。目前業(yè)內(nèi)常用的檢測(cè)技術(shù)有表面等離振子共振（Surfaceplasmonresonance,SPR）、Biacore分子互作系統(tǒng),、生物膜干涉技術(shù)（Bio-LayerInterferometry,BLI）、微量熱泳動(dòng)(MST)系統(tǒng),、等溫滴定量熱(ITC)系統(tǒng)和圓二色光譜(CD)結(jié)構(gòu)分析系統(tǒng),。

1、LSPR分子互作系統(tǒng)

親和力是判定分子間相互作用的重要參數(shù),，是了解分子以及藥物的發(fā)現(xiàn)與篩選等的重要指標(biāo),，除了親和力之外,，還有兩個(gè)對(duì)分子間相互作用評(píng)估至關(guān)重要的指標(biāo)（Ka，Kd）,。對(duì)于藥效的評(píng)價(jià),、生物大分子及其復(fù)合體的穩(wěn)定性的評(píng)估需要從動(dòng)力學(xué)、熱力學(xué)和熱穩(wěn)定性等方面進(jìn)行包括分子間的結(jié)合,、結(jié)合的快慢,、結(jié)合的強(qiáng)弱、結(jié)合的機(jī)理等多方面的全面性研究,。

基于LSPR平臺(tái)為生物醫(yī)藥研發(fā),、科研客戶提供相應(yīng)的分子互作分析測(cè)試服務(wù)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)蛋白,，抗體,、抗體片段、多肽,、DNA/RNA,、納米材料及小分子化合物等相互作用的定性定量分析，其次也可針對(duì)細(xì)胞裂解液,、核酸文庫(kù)等依托LSPR-Selex技術(shù)垂釣篩選未知靶點(diǎn),。

檢測(cè)范圍：檢測(cè)范圍包括：蛋白-蛋白、抗體-抗原,、蛋白-小分子,、抗體-多肽、蛋白-DNA,、DNA-DNA,、蛋白-納米材料等分子間相互作用力檢測(cè)；除了蛋白,、抗體外,，細(xì)胞裂解液、細(xì)菌等也可結(jié)合LSPR-MS質(zhì)譜等技術(shù)鑒定調(diào)控蛋白,；也可在藥物篩選,、醫(yī)療診斷、環(huán)境食品檢測(cè),、血液標(biāo)志物檢測(cè)等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用,。

樣品要求：
 1配體蛋白（標(biāo)記芯片）
1.1、純度大于90%
1.2,、濃度大于0.1ug/ul（盡可能高）,，提供10ug左右,。
1.3、需提供配體蛋白的等電點(diǎn)
1.4,、配體蛋白緩沖液盡量避免Tris等帶有氨基基團(tuán)的試劑
1.5,、避免顆粒或絮狀沉淀
2,、分析物（流動(dòng)相）
2.1,、純度大于80%
2.2、濃度大于0.1ug/ul（盡可能高）,，提供凍干粉最好,。根據(jù)樣本情況，提供10-100ug左右,。
2.3,、提供準(zhǔn)確分子量和濃度以及溶劑成分
2.4、溶劑最好不能含有有機(jī)化合物,，如：DMSO甘油,。如果一定需要加入有機(jī)溶劑，就盡量提供高濃度的分析物,，通過(guò)稀釋可以降低其含量比,。
2.5、盡可能不含有海藻糖,，BSA,，蔗糖等保護(hù)劑。如果一定需要加入,，需提供準(zhǔn)確的濃度,，以及盡可能提供高濃度含分析物原液，以便通過(guò)稀釋降低其含量比,，稀釋后上樣終濃度中抗原抗體保護(hù)劑濃度≦0.01%既可,。

2、Biacore分子互作系統(tǒng)

Biacore的檢測(cè)原理基于表面等離子共振技術(shù)（SPR）,，能夠靈敏地反映距離傳感芯片表面約150nm范圍內(nèi)折光率的變化,。為了研究?jī)蓚€(gè)分子之間的相互作用，其中一個(gè)分子被固定到芯片表面上,，而另一個(gè)分子以溶液的形式連續(xù)流過(guò)表面,。檢測(cè)器能跟蹤檢測(cè)溶液中的分子與芯片表面的分子結(jié)合、解離整個(gè)過(guò)程的變化,。SPR響應(yīng)值直接與芯片表面附近的質(zhì)量濃度變化成正比,。

BIAcore系統(tǒng)可以為很多領(lǐng)域提供有價(jià)值的信息包括：動(dòng)力學(xué)、親和力,、特異性,、熱力學(xué)和濃度等。Biacore系統(tǒng)原則上可以用于研究任何種類(lèi)分子間的相互作用：從候選的有機(jī)藥物分子到蛋白質(zhì),、核酸,、糖、甚至是病毒和全細(xì)胞,。因?yàn)轫憫?yīng)值與質(zhì)量濃度成正比,，因此每摩爾濃度的結(jié)合分子產(chǎn)生的信號(hào)與其分子量成正比（較小的分子量產(chǎn)生較低的響應(yīng)值）。現(xiàn)在分子量的實(shí)際檢測(cè)下限約為100Da（注：BiacoreT200對(duì)有機(jī)分子無(wú)分子量下限）,。

Biacore的檢測(cè)原理不需要對(duì)任何樣品分子進(jìn)行標(biāo)記,，既可以測(cè)定純化的樣品，也可以對(duì)復(fù)雜的混合物進(jìn)行分析,，比如細(xì)胞培養(yǎng)液上清,，細(xì)胞裂解液?；旌蠘悠返慕Y(jié)合過(guò)程受樣品中結(jié)合反應(yīng)物與固定在芯片表面的分子結(jié)合的特異性決定,。SPR檢測(cè)技術(shù)無(wú)需改變分子性質(zhì)，而且可檢測(cè)澄清,、有色或不透明的樣品,。

3、BLI生物膜干涉系統(tǒng)

ForteBio Octet分子相互作用分析系統(tǒng)是一種非標(biāo)記的,、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的先進(jìn)技術(shù),，主要用于生物分子間相互作用的全方位定量分析以及蛋白濃度測(cè)定。該平臺(tái)通過(guò)浸試即讀的檢測(cè)方式（DipandRead）,，可輕松處理未經(jīng)純化的樣品,，從而研究真實(shí)生物環(huán)境中樣品分子的相互作用和結(jié)合動(dòng)力學(xué)，這類(lèi)樣品通常無(wú)法在基于SPR的平臺(tái)上運(yùn)行,。如：分析未經(jīng)過(guò)濾的細(xì)胞培養(yǎng)上清和裂解液,；研究生物環(huán)境中分子之間相互作用；直接的病毒或病毒樣顆粒樣品親和力分析,。

檢測(cè)原理 —生物膜干涉技術(shù)（Bio-LayerInterferometry,，BLI）

生物膜干涉技術(shù)采用探針式生物傳感器對(duì)樣品直接進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)樣品無(wú)需做任何熒光或同位素標(biāo)記,。通過(guò)儀器發(fā)射白光到傳感器表面并收集反射光,，不同頻率的反射光譜受到生物傳感器的光膜層厚度的影響并形成干涉。因此,，結(jié)合到傳感器表面的分子一旦有數(shù)量上的增減,，光譜儀便會(huì)實(shí)時(shí)地檢測(cè)到干涉光譜的位移，而這種位移可直接反映出傳感器表面生物膜的厚度及密度變化,，從而對(duì)待測(cè)分子間的相互作用過(guò)程進(jìn)行精確的定量測(cè)定,。

4,、微量熱泳動(dòng)(MST)系統(tǒng)

提供MonolithNT.115微泳動(dòng)量熱生物分子相互作用檢測(cè)服務(wù)項(xiàng)目。微量熱泳動(dòng)（MicroScaleThermophoresis,，MST）是一種定量分析生物分子間相互作用的前沿技術(shù),，通過(guò)精確檢測(cè)熒光變化，結(jié)合靈敏的熱泳動(dòng)現(xiàn)象,，MST提供了一種靈活,、強(qiáng)大和快速測(cè)量分子間相互作用的方法。MST測(cè)試時(shí),，由紅外激光建立微觀溫度梯度場(chǎng),，通過(guò)熒光染料標(biāo)記、熒光融合蛋白,、色氨酸自發(fā)熒光等信號(hào)追蹤,，分子在微觀溫度梯度場(chǎng)中的定向移動(dòng)就可以被探測(cè)和量化。MST在緩沖液中操作,，無(wú)需任何表面固定,，因此即使對(duì)于體積較大、不穩(wěn)定的樣品,，比如脂質(zhì)體,、納米材料或者膜蛋白，也同樣適用,。MST將熒光檢測(cè)的精準(zhǔn)性與熱泳動(dòng)的靈活性及靈敏度結(jié)合起來(lái),，快速、可信地檢測(cè)分子間相互作用,。MST可用于檢測(cè)小分子之間,、蛋白和蛋白之間、多蛋白復(fù)合物之間的相互作用,，應(yīng)用范圍廣泛,。

5、等溫滴定量熱(ITC)系統(tǒng)

等溫滴定量熱系統(tǒng)提供MonolithNT.115微泳動(dòng)量熱生物分子相互作用檢測(cè)服務(wù)項(xiàng)目,。微量熱泳動(dòng)（MicroScaleThermophoresis,，MST），通過(guò)精確檢測(cè)熒光變化,，結(jié)合靈敏的熱泳動(dòng)現(xiàn)象,，MST提供了一種靈活、強(qiáng)大和快速測(cè)量分子間相互作用的方法,。

等溫滴定量熱法(ITC)是用于量化研究各種生物分子相互作用的一種技術(shù),，可以測(cè)定結(jié)合配偶體在自然狀態(tài)下的親和力，無(wú)需通過(guò)熒光標(biāo)記或固定化技術(shù)對(duì)結(jié)合配偶體進(jìn)行修飾。通過(guò)測(cè)量結(jié)合過(guò)程中的熱傳遞,，就能夠準(zhǔn)確地確定結(jié)合常數(shù)(KD),、反應(yīng)化學(xué)量(n)、焓(?H)和熵(ΔS),。這就提供了有關(guān)分子相互作用的完整熱力學(xué)信息,。ITC不僅可測(cè)定結(jié)合親和力，還能闡明潛在分子相互作用的機(jī)制,。

測(cè)量原理：
等溫滴定量熱法用來(lái)測(cè)定各生物分子之間的反應(yīng)。該方法可測(cè)定結(jié)合親和力,、化學(xué)計(jì)量以及溶液中結(jié)合反應(yīng)的熵和焓,，無(wú)需使用標(biāo)記。

工作原理：
熱核心：微量熱計(jì)中有兩個(gè)池,，其中一個(gè)含有水,，作為參比池，另一個(gè)含有樣品,。微量熱計(jì)必須使這兩個(gè)池保持完全相同的溫度,。熱敏裝置檢測(cè)發(fā)生結(jié)合時(shí)兩個(gè)池之間的溫差，并反饋給加熱器,，由加熱器來(lái)補(bǔ)償該溫差并使兩個(gè)池恢復(fù)到相同的溫度,。

進(jìn)行測(cè)量：參比池和樣品池被設(shè)定到所需的實(shí)驗(yàn)溫度。將配體裝入一個(gè)非常精確的注射裝置上的注射器中,。將注射裝置插入包含目標(biāo)蛋白質(zhì)的樣品池中,。將一系列小份配體試樣注入到蛋白質(zhì)溶液中。如果有配體與蛋白質(zhì)結(jié)合,，則可檢測(cè)到并測(cè)出幾百萬(wàn)分之一攝氏度的熱量變化,。進(jìn)行第一次注射時(shí)，微量熱計(jì)測(cè)量被釋放的所有熱量,，直到結(jié)合反應(yīng)達(dá)到平衡,。測(cè)得的熱量與結(jié)合量成正比。

結(jié)果和數(shù)據(jù)分析：

示例中,，反應(yīng)是放熱的,，意味著樣品池溫度高于參比池并由此導(dǎo)致信號(hào)出現(xiàn)下行波峰。隨著兩個(gè)池的溫度恢復(fù)到同一水平,，信號(hào)也回到其起點(diǎn),。將第二小份配體試樣注入到樣品池中，同樣,，微量熱計(jì)補(bǔ)償所檢測(cè)到小幅熱量變化,。配體與蛋白質(zhì)之間的摩爾比隨著一系列配體試樣的注入而逐漸增加。蛋白質(zhì)越來(lái)越飽和，配體結(jié)合的次數(shù)越來(lái)越少,，并且熱量變化開(kāi)始減小,，直到樣品池中的配體數(shù)量相對(duì)于蛋白質(zhì)而言最終表現(xiàn)出過(guò)量為止，從而使反應(yīng)朝飽和的方向進(jìn)行,。

然后對(duì)每個(gè)峰的面積進(jìn)行積分,，并以配體與蛋白質(zhì)的摩爾比作為橫坐標(biāo)進(jìn)行繪圖。由此得出的等溫線可擬合至導(dǎo)出親和力(KD)的結(jié)合模型,。結(jié)合等溫線中心的摩爾比即為反應(yīng)化學(xué)計(jì)量,。下圖給出了1:1結(jié)合反應(yīng)的示例圖。

焓(ΔH)也可通過(guò)等溫線直接導(dǎo)出,，它表示每摩爾結(jié)合配體所釋放的熱量,。這就意味著一次ITC實(shí)驗(yàn)就可提供豐富的結(jié)合反應(yīng)信息，有助于理解相互作用的性質(zhì)并探索熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)因素,。

6,、圓二色光譜(CD)結(jié)構(gòu)分析系統(tǒng)

利用蛋白質(zhì)的圓二色性及不對(duì)稱分子對(duì)左右圓偏振光吸收的不同來(lái)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。圓二色譜在遠(yuǎn)紫外區(qū)的掃描圖譜,，反映的是蛋白質(zhì)肽鍵的排布信息,，計(jì)算所得的是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)比例，即α-螺旋,、β旋折疊,、轉(zhuǎn)角和不規(guī)則卷曲的比例；圓二色譜在近紫外區(qū)的掃描圖譜,，反映的是蛋白質(zhì)側(cè)鏈生色基團(tuán)色氨酸,、苯丙氨酸、酪氨酸等殘基的排布信息和二硫鍵微環(huán)境的變化,。

基本流程：

客戶提供：

提供樣品:

遠(yuǎn)紫外：濃度＞0.5mg/ml,，樣本量＞200μg，純度＞90%,；
近紫外：濃度＞5mg/ml,，樣本量＞2mg，純度＞90%,；
不要添加任何保護(hù)劑或其他物質(zhì)（透明性極好的磷酸鹽可用作緩沖體系）

提供信息：
樣品制備方法及緩沖液信息,、純度檢測(cè)方法及結(jié)果圖譜數(shù)據(jù)；
樣品如被修飾,，請(qǐng)?jiān)敿?xì)告知修飾方法,。