構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的基本原理是將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上,，載體被轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞并整合到宿主染色體中,，用載體中所含抗性基因進(jìn)行篩選，可得到穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白,、或者穩(wěn)定表達(dá)沉默特定基因的細(xì)胞株,，即穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株主要有兩種方法：線性質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法和慢病毒感染法,。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染受制于質(zhì)粒大小,、轉(zhuǎn)染介質(zhì)的限制，對很多細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低,，而且質(zhì)粒整合入細(xì)胞基因組的效率極低,，所以構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株的成功率不高。而慢病毒幾乎可以感染所有種類的細(xì)胞,，并且在感染后容易整合到受感染細(xì)胞的基因組,，進(jìn)行長時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)，因此,，慢病毒是目前用于構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株最主流的方法,。

構(gòu)建流程以及注意事項(xiàng)

1. 慢病毒載體構(gòu)建，過表達(dá)載體或者干擾載體構(gòu)建

慢病毒過表達(dá)載體有基因容量限制,，對于大于5k的基因,，包裝出慢病毒的概率很低，不建議包裝病毒,。同時(shí)大于3k的目的基因也可能有不出毒或者出毒量低,，在做正式實(shí)驗(yàn)之前，可用先進(jìn)行病毒的小量包裝,，成功后再進(jìn)行病毒大量包裝,。對于敲低，通常的策略是對一個(gè)基因同時(shí)選擇3個(gè)干擾靶點(diǎn),，通過qPCR驗(yàn)證干擾效率之后,，使用效率好的靶點(diǎn)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

慢病毒載體帶有不同的標(biāo)簽,，如果研究細(xì)胞定位,，可以選擇帶熒光標(biāo)簽的慢病毒載體，比如帶GFP/RFP等,；如果準(zhǔn)備篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,，可以選擇帶篩選標(biāo)簽的慢病毒載體，比如puro/neo等載體,；如果目的基因大小適中,，也可以選擇同時(shí)帶熒光標(biāo)簽和篩選標(biāo)簽的載體。

慢病毒過表達(dá)載體,，同時(shí)帶puro抗性,、GFP熒光

2. 293T細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒包裝
細(xì)胞的狀態(tài)對于病毒包裝有很大的影響，如果細(xì)胞狀態(tài)不好可能不出毒或者出毒量很低,。取狀態(tài)良好,，處于對數(shù)生長期的293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝。第三代四質(zhì)粒包裝質(zhì)粒配比,，可以按照分子量來折算,，并在附近量做實(shí)驗(yàn)，摸索最適質(zhì)粒配比,，以得到更高滴度的病毒,。

慢病毒包裝圖

3. 慢病毒滴度檢測及保存，使用熒光梯度稀釋法或者qPCR法檢測

慢病毒表達(dá)時(shí)間較慢,，熒光表達(dá)所需時(shí)間較長,，建議感染后72小時(shí)后觀測熒光表達(dá)或者qPCR檢測。感染期間請根據(jù)細(xì)胞生長的情況對細(xì)胞進(jìn)行及時(shí)換液,，以保證細(xì)胞良好的生長狀態(tài),。值得考慮的是使用低濃度的血清來培養(yǎng)細(xì)胞，作用是抑制細(xì)胞增殖,。

特別注意,，慢病毒可以存放于-80℃6個(gè)月以上，但如果病毒儲存時(shí)間超過6個(gè)月,，建議在使用前重新滴定病毒滴度,。反復(fù)凍融會降低病毒滴度，每次凍融會降低病毒滴度10%,，因此,，在病毒使用過程中應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融，強(qiáng)烈建議收到病毒后按照每次的使用量將病毒進(jìn)行分裝,。

4. 目的細(xì)胞MOI值摸索,，確定最適慢病毒感染復(fù)數(shù)

同一種細(xì)胞在不同實(shí)驗(yàn)室中由于傳代次數(shù)、操作細(xì)節(jié)的不同,，細(xì)胞狀態(tài)會有所差異,，另一方面病毒液在運(yùn)輸,、保存過程中可能造成即時(shí)滴度的變化。因此為了達(dá)到最佳的實(shí)驗(yàn)效果,，建議在正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行3-4種不同MOI的感染預(yù)實(shí)驗(yàn),。細(xì)胞匯合度對抗生素篩選結(jié)果的影響很大，一般篩選時(shí)細(xì)胞匯合度不宜超過50%,。

5. 目的細(xì)胞藥物篩選濃度確定-通過梯度實(shí)驗(yàn)

使用不同濃度的抗生素對細(xì)胞進(jìn)行處理,，選擇出在10-14天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低抗生素濃度來進(jìn)行下一步的篩選試驗(yàn)。不同的細(xì)胞對于同一種抗生素,，其篩選濃度不同,，而同一種細(xì)胞對于不同的抗生素，其最佳使用濃度也不同,。所以在進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選之前,，一定要先進(jìn)行藥物濃度篩選預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定最佳藥物篩選濃度。

6. 慢病毒感染目的細(xì)胞篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株

由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時(shí)間才能表達(dá)出蛋白質(zhì),，所以篩選不能太早,，但是也不能太晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大,，增值較慢,，時(shí)間長了就會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒，最終導(dǎo)致篩選不出陽性克隆,。一般在轉(zhuǎn)染24小時(shí)之后才開始加抗生素記性篩選,。加藥篩選后，死亡的細(xì)胞會裂解釋放出有害物質(zhì),，導(dǎo)致那些有抗生素表達(dá)的陽性細(xì)胞死亡,，即非選擇性死亡，因此要及時(shí)換液,。

篩選的穩(wěn)轉(zhuǎn)株圖

7. 穩(wěn)轉(zhuǎn)株檢測

通過qPCR或者Western Blot檢測目的基因,，需要注意的是，mRNA的表達(dá)水平可能和蛋白的表達(dá)水平不一致,，如果需要進(jìn)一步研究蛋白的功能,，可以使用WB檢測蛋白的表達(dá)水平。

干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)株qPCR檢測

過表達(dá)慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株Western Blot檢測（4株不同細(xì)胞）

一般需要構(gòu)建穩(wěn)定株的情況如下：

1. 長期在目的細(xì)胞中研究基因功能,，通過構(gòu)建穩(wěn)定株,，可以大大降低頻繁轉(zhuǎn)染或者病毒包裝的成本，也極大方便實(shí)驗(yàn)研究,；

2. 部分蛋白半衰期極長,，瞬時(shí) RNA 只能干擾表達(dá)，無法去除已經(jīng)表達(dá)的目的蛋白，通過構(gòu)建穩(wěn)定株可以實(shí)現(xiàn)更好的基因干擾效果,；

3. 瞬轉(zhuǎn)往往會引入極高拷貝數(shù)的表達(dá),，導(dǎo)致因?yàn)槿藶橐蛩卦斐蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果的不精確，構(gòu)建穩(wěn)定株可以幫助篩選拷貝數(shù)適量的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,；

4. 需要用誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的,，主要是一些致死基因或者是需要時(shí)空表達(dá)的；

5. 需要用細(xì)胞做動物實(shí)驗(yàn)的,，比如裸鼠成瘤等，往往需要構(gòu)建成穩(wěn)轉(zhuǎn)株,。